自誘導(dǎo)系統(tǒng)在酶促合成2’-脫氧胞苷中的應(yīng)用

王璽段勝林熊舒莉鄭桂蘭張貴友王洪鐘

（1.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

自誘導(dǎo)系統(tǒng)在酶促合成2’-脫氧胞苷中的應(yīng)用

王璽1段勝林2熊舒莉1鄭桂蘭1張貴友1王洪鐘1

（1.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

旨在高效合成2’-脫氧胞苷（dCyd）。DCyd作為一類重要的藥物中間體，能夠用于合成吉西他濱（dFdC）、扎西他濱（ddC）等多種抗病毒或抗腫瘤的藥物。采用ZYM-Fe-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基對含有N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II（NDT）的大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)，所得完整菌體直接用于催化合成dCyd。結(jié)果表明，自誘導(dǎo)系統(tǒng)不僅無需額外添加誘導(dǎo)劑，還能夠達(dá)到較高的菌體密度，且與LB誘導(dǎo)系統(tǒng)所得菌體在合成dCyd方面具有同樣高效的催化活性。2’-脫氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的濃度比為1∶3時，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率可高達(dá)86.5%。合成dCyd的最適反應(yīng)條件為：2’-脫氧胸苷（dThd）和胞嘧啶的濃度比為1∶1.5，pH6.5的磷酸緩沖液，1 mg/mL的菌體量，終體系10 mL，30℃條件下反應(yīng)1 h，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率可達(dá)71.9%。此方法還可用于制備其他核苷類似物，具有廣泛的適用性和應(yīng)用前景。

生物催化 N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶 2’-脫氧胞苷 自誘導(dǎo)系統(tǒng) 核苷類似物

核苷類家族不僅包含多種天然核苷，還包括堿基或糖基被修飾過的核苷類似物［1］。核苷類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與天然核苷有著不同程度的相似性，在細(xì)胞代謝中，可與正常核苷形成競爭關(guān)系，具有干擾核酸的合成及抑制相關(guān)聚合酶結(jié)合的作用，進(jìn)而阻斷腫瘤細(xì)胞和病毒的復(fù)制［2］。大部分的核苷類似物可以在治療癌癥和病毒感染的疾病中發(fā)揮重要作用［3-5］。其中，2’-脫氧胞苷（2’-deoxycytidine，dCyd）就是一類重要的藥物中間體，能夠用于合成抗癌藥物吉西他濱（dFdC）、抗HIV病毒藥物扎西

他濱（ddC）及生化試劑脫氧胞苷-5’-單磷酸（5’-dCMP）［6］等。目前，制備核苷類似物的方法主要有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。傳統(tǒng)的化學(xué)合成法存在步驟繁多，反應(yīng)條件苛刻，產(chǎn)物純度低、分離困難，收率不高等缺點［7，8］，故在工業(yè)生產(chǎn)中很少使用。生物轉(zhuǎn)化法主要用到兩種酶：核苷磷酸化酶和N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶，前者通過2步反應(yīng)可逆地催化核苷（或脫氧核苷）生成核糖-1-磷酸和堿基，核糖-1-磷酸再與另一種堿基結(jié)合生成新的核苷，但此酶不能用于催化合成胞嘧啶核苷類化合物［9］；后者主要來源于大腸桿菌、萊氏乳細(xì)菌和瑞士乳桿菌［10］，可通過一步催化反應(yīng)高效地合成核苷類似物，反應(yīng)過程中無中間體的產(chǎn)生［9］，且底物適用范圍更廣。

N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶最先是由MacNutt在瑞士乳桿菌中發(fā)現(xiàn)的［11］。隨后有研究者利用親和層析的方法從瑞士乳桿菌中純化得到含有兩種不同活性的N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶［12］：I 型（PDT），只能催化兩種嘌呤堿基之間的轉(zhuǎn)換反應(yīng)（Pur ? Pur）；II型（NDT），不僅可以催化兩種嘌呤之間的轉(zhuǎn)換，還能夠催化嘧啶與嘧啶、嘌呤與嘧啶之間的相互轉(zhuǎn)換（Pur ?Pur，Pur ? Pyr，Pyr ? Pyr）［13，14］。N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II（NDT）的底物識別范圍較廣，能夠用于合成多種有重要藥用價值的核苷類似物［15，16］，但其更傾向于催化以脫氧嘧啶核苷為底物的反應(yīng)［17］。已有文獻(xiàn)報道，NDT基因的開放閱讀框由474個核苷酸組成，用于編碼158個氨基酸［18］。本試驗即利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建得到含有NDT的原核表達(dá)菌，以脫氧胸苷和胞嘧啶為底物，在重組菌體的催化下高效合成2’-脫氧胞苷。

IPTG是對于lac基因簇十分有效的誘導(dǎo)劑，人們對其的研究已經(jīng)比較成熟［19］。但由于IPTG具有價格昂貴、細(xì)胞毒性大等缺點，在菌種的大規(guī)模培養(yǎng)中不太適用［20］，而乳糖相對廉價且可以代替IPTG誘導(dǎo)乳糖操縱子的表達(dá)［21］。本試驗即利用含有乳糖的ZYM-Fe-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)構(gòu)建得到的重組大腸桿菌BL21/pET28a-ntd（BN）細(xì)胞，收集得到的全菌體直接用于催化2’-脫氧胞苷的合成。此自誘導(dǎo)培養(yǎng)基是由Studier在標(biāo)準(zhǔn)5052培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良得到的［22］，其中0.5%的甘油、0.05%葡萄糖和100 μmol/L FeCl3有利于菌體的高密度培養(yǎng)［23］，而0.2%的乳糖可以誘導(dǎo)酶的過量表達(dá)。本試驗對比傳統(tǒng)LB誘導(dǎo)系統(tǒng)與自誘導(dǎo)培養(yǎng)途徑獲得的菌體的生物轉(zhuǎn)化活性，并對全菌體催化合成2’-脫氧胞苷的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的進(jìn)一步應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 胞嘧啶、胸腺嘧啶、脫氧胸苷和脫氧胞苷均購自于上海得恩德醫(yī)藥科技有限公司，Ex Taq DNA聚合酶、Nde I和EcoR I限制性內(nèi)切酶均購自于TaKaRa生物技術(shù)有限公司，DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器 Waters 600 series高效液相色譜儀，PCR儀，SDS-PAGE蛋白電泳系統(tǒng)，DYⅢ20A型水平電泳槽，紫外分光光度計，恒溫?fù)u床，離心機等。

1.1.3 菌種和質(zhì)粒 瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）購自于中國普通微生物菌種保藏管理中心，pMD18-T質(zhì)粒，克隆菌株大腸桿菌DH5α和表達(dá)菌株大腸桿菌BL21（DE3）均購自于全式金生物技術(shù)公司，pET-28a（+）質(zhì)粒購自于Novagen公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 MRS液體培養(yǎng)基 蛋白胨1%，牛肉膏1%，葡萄糖0.5%，酵母提取物0.5%，檸檬酸二銨0.2%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%，碳酸鈣2%。用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8，121℃滅菌15 min。

1.1.4.2 LB液體培養(yǎng)基 酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉1%，121℃滅菌15 min。

1.1.4.3 ZYM-Fe-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基 蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，甘油0.5%，0.2%乳糖，0.05%葡萄糖，25 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NH4Cl，25 mmol/L KH2PO4，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，100 μmol/L FeCl3，121℃滅菌15 min。

配制相應(yīng)的固體培養(yǎng)基時，加入1.5%左右的瓊脂后滅菌。

將含有目的基因片段的瑞士乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)［24］。構(gòu)建完成的原核表達(dá)菌株利用兩種誘導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)：LB培養(yǎng)基加IPTG誘導(dǎo)

劑和ZYM-Fe-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)菌株的構(gòu)建 將瑞士乳桿菌干粉于MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后，傳代進(jìn)行2次培養(yǎng)，以此菌液為模板進(jìn)行PCR來擴增目的片段。利用GenBank中查找得到的瑞士乳桿菌N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II基因（ndt）的核酸序列（登錄號：NC-010080），設(shè)計一對擴增引物：ndt（+）：5'-CGCCATATGATGAACAAGAAAAAGAC-3'和 ndt（-）5'-CGGGAATTCTTAATATACAGCTCCG-3'，下劃線標(biāo)注序列分別為Nde I和EcoR I限制性酶切位點。PCR反應(yīng)體系中包含10×Ex Taq緩沖液II 5 μL，dNTP 5 μL，引物各0.5 μL，菌液模板1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，補加ddH2O至終體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火60 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃保溫10 min，4℃保存。

利用DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物中的目的片段進(jìn)行回收，與pMD18-T克隆載體在16℃條件下連接8 h后，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過測序及序列比對篩選獲得陽性克隆菌株。然后用Nde I和EcoR I限制性內(nèi)切酶分別對pMD18-T-ndt和pET-28a質(zhì)粒在37℃水浴鍋中進(jìn)行雙酶切，所需酶切片段進(jìn)行DNA回收后16℃條件下連接8 h，并轉(zhuǎn)化導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21（DE3）中，篩選得到重組大腸桿菌BL21-pET28a-ndt（BN）陽性表達(dá)菌株。

1.2.2 N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II基因的表達(dá)及SDSPAGE檢測 表達(dá)菌株BN在兩種誘導(dǎo)系統(tǒng)中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，利用分光光度計分別測定兩種誘導(dǎo)途徑所產(chǎn)生的菌體密度的增長曲線。用于獲得含酶菌體的兩種誘導(dǎo)方法為：①將1 mL過夜復(fù)蘇培養(yǎng)的BN菌液加入到50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的傳統(tǒng)LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為1.0左右，加入0.1 mmol/L的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。②將1 mL過夜復(fù)蘇的BN菌液加入到50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的ZYM-Fe-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)總時間與LB誘導(dǎo)系統(tǒng)相同。誘導(dǎo)結(jié)束后，6 000×g離心10 min收菌，用pH7.0的磷酸緩沖液沖洗一次，菌體保存于-20℃待用。

誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后分別取1 mL菌液，用于SDSPAGE檢測。取樣菌液在12 000 r/min離心2 min，棄上清，沉淀用30 μL的無菌水和10 μL 4×蛋白SDS-PAGE上樣緩沖液重懸，并將重懸溶液于沸水中煮10 min，12 000 r/min離心2 min，取2.5 μL上清用于檢測目的蛋白是否成功表達(dá)，并以含有空白pET-28a（+）質(zhì)粒的BL21（DE3）表達(dá)菌株作為對照。所用SDS-PAGE分離膠濃度為15%。

1.2.3 N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II的活性測定 以脫氧胸苷和胞嘧啶為底物，利用表達(dá)N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II的完整菌體催化合成脫氧胞苷，通過高效液相色譜儀（HPLC）檢測酶蛋白的催化活性，其反應(yīng)式如圖1所示。

圖1 合成2’-脫氧胞苷的反應(yīng)式

初定的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系（終體積10 mL）為：30 mmol/L 脫氧胞苷和45 mmol/L 胞嘧啶（底物比1∶1.5）溶于50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中，在5 mg/mL完整細(xì)胞的催化下，40℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液于沸水中保溫5 min以終止酶反應(yīng)，冷卻至室溫，然后用超純水稀釋20倍，并用0.45 μm的濾器過濾上清液，用于HPLC的上樣檢測。

HPLC檢測條件為：色譜柱選用Diamonsil C18柱，5 μm（φ250×4.6 mm），紫外檢測波長為245 nm，流動相為15%的甲醇和85%的水，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為25℃。

HPLC圖譜中目的產(chǎn)物的峰面積和產(chǎn)物的產(chǎn)量成正比，本試驗以此為基礎(chǔ)制定了脫氧胞苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線及反應(yīng)結(jié)束后目的產(chǎn)物的峰面積，可以計算得到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率（T）的計算方法為：T=（實際脫氧胞苷的產(chǎn)物峰面積/理論

所得脫氧胞苷的產(chǎn)物峰面積）×100%。

1.2.4 酶催化條件的優(yōu)化 依據(jù)N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II的酶學(xué)性質(zhì)［25］及考慮其他可能影響產(chǎn)物生成率的因素，在試驗中分別測定了不同菌體量（1、2.5、5和10 mg）、不同反應(yīng)溫度（20℃、30℃、40℃、50℃和60℃）對dCyd轉(zhuǎn)化率的影響。并且依據(jù)已有文獻(xiàn)報道，N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II（NDT）在pH接近7.0時催化活性最高［8］，故選擇測定了酸堿度在中性左右的4組不同pH的磷酸緩沖液（5.8、6.5、7.0和7.8）對催化反應(yīng)的影響。另外，在可逆反應(yīng)中，不同的底物濃度比對目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率也會存在不同程度的影響。本研究選用相對廉價的脫氧胸苷和胞嘧啶為底物來合成2’-脫氧胞苷，其中，胞嘧啶的價格低于脫氧胸苷?？紤]經(jīng)濟(jì)因素，選擇測定了5組不同的底物濃度比（2’-脫氧胸苷∶胞嘧啶為1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2和1∶3）對dCyd轉(zhuǎn)化率的影響。

2 結(jié)果

2.1 N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II基因的克隆及重組菌株

的構(gòu)建

本試驗以瑞士乳桿菌全菌體為模板通過PCR得到N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II的基因片段，目的片段回收后的電泳條帶（圖2-A）顯示，其大小在500 bp左右。NDT基因與pMD18-T質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中，得到陽性克隆菌株菌落鑒定結(jié)果（圖2-B），經(jīng)測序后與GenBank中查找到的序列對比，結(jié)果表明序列一致。提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后，將目的片段與pET-28a（+）質(zhì)粒相連接，導(dǎo)入表達(dá)菌BL21（DE3）中，獲得序列一致的陽性表達(dá)菌BN，其菌落鑒定結(jié)果（圖2-C）表明，已成功構(gòu)建得到含有NDT的原核表達(dá)菌株。

圖2 ndt的PCR擴增及菌落鑒定

2.2 N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II基因的表達(dá)及SDS-PAGE檢測

表達(dá)菌株BN在兩種誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)相同時間后，離心收集菌體。菌體總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析（圖3）表明，兩種誘導(dǎo)途徑均能成功誘導(dǎo)得到目的蛋白。由于重組N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II的N端連接一段約2 kD的His標(biāo)簽，故重組酶蛋白的大小在20 kD左右，SDS-PAGE圖中目的條帶位置與預(yù)測的一致。

圖3 重組NDT的SDS-PAGE檢測

另外，在OD600的條件下，菌體密度測定的結(jié)果（圖4）表明，加入0.1 mmol/L 的IPTG之后，菌體量的增長也會受到抑制。BN菌株在兩種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)4 h后，自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的菌體密度明顯高于LB誘導(dǎo)系統(tǒng)，在誘導(dǎo)結(jié)束后，NDT酶的總含量也有相應(yīng)的提高（圖3）。

圖 4 兩種誘導(dǎo)途徑的菌體生長曲線

2.3 N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶II的活性測定

為計算產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，測定了2’-脫氧胞苷標(biāo)準(zhǔn)樣的質(zhì)量與HPLC圖譜峰面積之間的關(guān)系，制定了標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。為了測定酶是否具有催化活性，利用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系在30℃條件下反應(yīng)15 min后，對反應(yīng)樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果（圖6）表明含有NDT的完整細(xì)胞能夠成功催化2’-脫氧胞苷的合成。

圖5 2’-脫氧胞苷（dCyd）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 表明NDT催化活性的具有代表性的HPLC圖譜

此外，本試驗還測定了不同量的菌體對產(chǎn)物生成率的影響，結(jié)果（圖7-A）表明誘導(dǎo)后的重組細(xì)胞具有很高的催化活性，1 mg/mL的菌體量就足以快速催化產(chǎn)物的合成，而菌體用量越多，雜酶的含量也相應(yīng)增多，從而引發(fā)更多的副反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物量隨著反應(yīng)時間的延長而下降。對比兩種誘導(dǎo)途徑得到的相同的菌體量對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響（圖7-B和圖7-C），并對各個時間點的兩組平行數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和T檢驗，統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果顯示兩組數(shù)據(jù)在0.05水平上不具備顯著性差異，表明自誘導(dǎo)培養(yǎng)途徑得到的完整菌體與傳統(tǒng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到的菌體具有同樣高效的催化活性。

2.4 合成2-脫氧胞苷的催化條件的優(yōu)化

2.4.1 反應(yīng)溫度對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響 試驗測定了不同反應(yīng)溫度對催化合成2’-脫氧胞苷的影響，反應(yīng)1 h后的結(jié)果（圖8-A）表明，在30℃反應(yīng)條件下，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率較高且產(chǎn)物量相對比較穩(wěn)定。

2.4.2 緩沖液pH對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響 不同酸堿度的緩沖液的影響（圖8-B）表明，構(gòu)建得到的全菌體在弱酸性條件下的催化活性較高，即pH為6.5的條件下能夠獲得較高的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。

2.4.3 底物濃度比對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響 測定兩種底物濃度比的影響（圖8-C）表明，兩種底物間濃度比越大，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率越高，當(dāng)脫氧胸苷∶胞嘧啶為1∶3時，2’-脫氧胞苷的轉(zhuǎn)化率可高達(dá)86.5%。

3 討論

本試驗通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建得到含有NDT的重組菌株，用于高效一步反應(yīng)催化合成2’-脫氧胞苷（dCyd）。構(gòu)建菌株的誘導(dǎo)表達(dá)采用了兩種不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)：傳統(tǒng)LB培養(yǎng)基加IPTG和ZYMFe-5052自誘導(dǎo)系統(tǒng)，其中自誘導(dǎo)培養(yǎng)基由于含有少量的甘油及FeCl3等成分，有利于獲得更高的菌體密度及目的酶量［22］。同時，α-乳糖作為誘導(dǎo)劑，其價格和毒性均低于IPTG。

本研究是首次采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基對含有NDT的重組菌體進(jìn)行誘導(dǎo)，并用誘導(dǎo)后的完整菌體催化合成dCyd。相關(guān)結(jié)果表明，試驗構(gòu)建的表達(dá)菌株能夠高效催化底物轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物，但產(chǎn)物量會隨反應(yīng)時間的延長有所降低，原因可能是表達(dá)菌株內(nèi)固有

的轉(zhuǎn)氨酶催化目的產(chǎn)物發(fā)生了分解反應(yīng)，且轉(zhuǎn)氨酶在60℃條件下的活性較高，但在30℃條件下其活性可以被有效抑制［26］。降低表達(dá)菌株中固有酶對催化反應(yīng)的影響，是很值得后續(xù)研究的方面，以便于在核苷類似物的工業(yè)化生產(chǎn)過程中獲得穩(wěn)定的產(chǎn)物量。

圖7 不同菌量及兩種誘導(dǎo)途徑對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響

圖8 不同反應(yīng)條件對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響

試驗測定了不同反應(yīng)條件對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果表明重組酶具有很高的催化活性，能夠在短時間內(nèi)達(dá)到較高產(chǎn)率。綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素和產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，認(rèn)為脫氧胸苷∶胞嘧啶為1∶1.5時為較適宜的底物濃度比。此濃度比與1∶1相比，底物中增加了15 mmol/L的胞嘧啶，但底物仍能夠很好的溶解，而且胞嘧啶價格低于胸腺嘧啶，此濃度比與1.5∶1條

件下的產(chǎn)物生成率相當(dāng)；而與1∶2相比，第2次增加15 mmol/L的胞嘧啶對產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的提升相對較??；當(dāng)濃度比為1∶3時，胞嘧啶不能較好地溶解，底物浪費程度高。依據(jù)結(jié)果，合成2’-脫氧胞苷適宜的反應(yīng)條件為：30 mmol/L的脫氧胸苷和45 mmol/L的胞嘧啶，溶解于pH6.5的磷酸緩沖液中，加入1 mg/mL BN完整細(xì)胞在30℃條件下反應(yīng)1 h，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率可達(dá)71.9%。

到目前為止，自誘導(dǎo)培養(yǎng)基在酶蛋白的過量表達(dá)方面使用較少，所以本研究可以為自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的廣泛應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。此方法的優(yōu)點在于無需在培養(yǎng)過程中額外添加誘導(dǎo)劑，簡化了誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程，減少了污染的可能性；乳糖作為誘導(dǎo)劑，其價格和毒性都低于IPTG；使用全菌體進(jìn)行反應(yīng)，省去了蛋白純化的過程；自誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)還能夠獲得更高的菌體密度及目的蛋白量，且此方法獲得的全菌體與傳統(tǒng)誘導(dǎo)途徑得到菌體的催化活性同樣高效，故更適宜應(yīng)用于核苷類似物的大規(guī)模生產(chǎn)過程。本試驗還利用重組BN完整細(xì)胞成功催化5-雜氮-2’-脫氧胞苷的合成，表明此重組細(xì)胞及誘導(dǎo)方法適用于多種核苷類似物的合成，因此具有很大的應(yīng)用價值及前景。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建含有NDT酶的全菌體用于高效催化合成2’-脫氧胞苷。試驗采用的自誘導(dǎo)方法操作簡便，無需額外添加誘導(dǎo)劑；與傳統(tǒng)LB誘導(dǎo)方法相比，在培養(yǎng)相同時間后，能夠獲得更高的菌體量及目的蛋白量，并且相同菌體量的催化能力相似，為自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的進(jìn)一步應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Application of Auto-induction System in the Synthesis of 2’-deoxycytidine

Wang Xi1Duan Shenglin2Xiong Shuli1Zheng Guilan1Zhang Guiyou1Wang Hongzhong1
（1. School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084；2. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015）

This experiment was carried out in order to synthesize 2’-deoxycytidine（dCyd）more efficiently. DCyd is a significant intermediate for many antiviral and anticancer drugs such as Gemcitabine（dFdC）, Dideoxycytidine（ddC）, etc. A convenient and efficient bioprocess was reported here to synthesize dCyd by E.coli BL21（DE3）containing gene of N-deoxyribosyltransferaseⅡ（NDT）overexpressed using ZYM-Fe-5052 auto-induction system. The results showed that auto-induction system could make the addition of inducer during cultivation unnecessary and obtain a higher cell density. The recombinant cells from auto-induction system were as efficient as that from LB system on the conversion yields of dCyd. When the ratio of 2’-deoxythymidine（dThd）and cytosine was 1∶3, the conversion yield could be 86.5%. The substrates ratio of 2’-deoxythymidine (dThd) and cytosine as 1∶1.5 and 1 mg/mL recombinant cells which were dissolved in phosphate buffer of pH6.5, then cultured at 30℃ for 1 h were selected as the suitable reaction conditions，and the conversion yield could be 71.9%. This method also has potential for the preparation of other nucleoside analogues.

Biocatalysis N-deoxyribosyltransferase 2’-deoxycytidine Auto-induction system Nucleoside analogues

2014-03-31

國家自然科學(xué)基金項目（21176138），國家自然科學(xué)基金國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項目（J1103506，J1030622，J1310020）

王璽，女，碩士，研究方向：生物轉(zhuǎn)化及生物催化；E-mail：wangxi1822@163.com

王洪鐘，男，博士，副教授，研究方向：生物轉(zhuǎn)化及生物催化；E-mail：hzwang@mail.tsinghua.edu.cn