顧鈺霞, 劉乃豐

(東南大學醫(yī)學院 心血管研究所，東南大學附屬中大醫(yī)院 心血管內(nèi)科,江蘇 南京 210009)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病),尤其是心肌梗死,已經(jīng)成為威脅人類健康的最主要原因[1]。目前冠心病的治療原則主要包括生活方式管理、控制危險因素、藥物干預以及血運重建,但是這些都不能從根本上控制疾病的發(fā)展。而內(nèi)皮祖細胞可以在心肌缺血的情況下特異性歸巢至缺血部位,參與內(nèi)皮修復及血管新生,進而縮小缺血面積,保護心臟功能,因此內(nèi)皮祖細胞的研究為冠心病的治療提供了新的思路,已經(jīng)受到越來越多的關注。作者對內(nèi)皮祖細胞在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的作用及研究進展作一綜述。

1 內(nèi)皮祖細胞的生物學特征

1.1 內(nèi)皮祖細胞的來源

目前,我們一致認為內(nèi)皮祖細胞主要來源于骨髓,骨髓中有多種細胞具有內(nèi)皮祖細胞特征。內(nèi)皮祖細胞不僅存在于骨髓中,研究證實外周血中也存在內(nèi)皮祖細胞,但含量很少,僅占外周細胞的0.01%。Asaharad等[2]于1997年在科學雜志上發(fā)表了一篇具有里程碑意義的文章,文章中首次使用磁珠法從人外周血中分離出內(nèi)皮祖細胞,該實驗同時證實外周血中的內(nèi)皮祖細胞來源于骨髓,后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)臍靜脈血中也存在內(nèi)皮祖細胞。目前,如果在PubMed數(shù)據(jù)庫中使用內(nèi)皮祖細胞作為關鍵詞,可以搜索到10 000多個相關文獻[3]。在各種刺激及應激情況下,內(nèi)皮祖細胞可以動員至外周血中參與修復損傷的血管,同時更多的研究表明血管新生的原因是損傷血管周圍內(nèi)皮細胞的修復以及骨髓中內(nèi)皮祖細胞的動員。近10年來許多科學家試圖去闡明內(nèi)皮祖細胞的定義、起源、功能以及內(nèi)皮祖細胞在心血管疾病中的作用[4]。

1.2 內(nèi)皮祖細胞的鑒定

現(xiàn)階段內(nèi)皮祖細胞的鑒定主要有以下兩種方法。一種方法是免疫細胞法,該方法主要通過檢測細胞表面特有的抗原標記物,如CD34+、CD133+、VEGFR2+等。其中CD34已被廣泛用于鑒定骨髓來源的造血祖細胞和干細胞,其在介導細胞間黏附作用中發(fā)揮重要作用[5],而存在于分化成熟和參與血管新生的內(nèi)皮細胞表面的VEGFR2在內(nèi)皮細胞的成熟和遷移過程中起著關鍵作用[6]。隨后的研究表明,CD133(又稱AC133)也是一種早期造血干細胞的表面標記物,在內(nèi)皮祖細胞表面有表達,而成熟內(nèi)皮細胞表面卻沒有[7],故認為CD34+/CD133+/VEGFR2+細胞為內(nèi)皮祖細胞,內(nèi)皮祖細胞釋放入外周血后CD133逐漸消失,CD34表達下調(diào),而VEGFR2能持續(xù)表達。此外,另有一些內(nèi)皮祖細胞表面抗原標記物,如sca- 1+/VEGFR2+(Flk1)和c- kit+/VEGFR2+也被廣泛應用于小鼠內(nèi)皮祖細胞的識別[8- 10]。其他用于識別內(nèi)皮祖細胞的表面抗原標記物,如血管性血友病因子(vWF)、CD31 和 CD144實際上是成熟內(nèi)皮細胞的標志[10],而另一個內(nèi)皮祖細胞的潛在表面標記物CXCR4在許多細胞表面都有表達[11]。因此,目前為止沒有已經(jīng)被定義的細胞表面抗原標記物可以明確地將內(nèi)皮祖細胞和其他循環(huán)血細胞區(qū)別開來。另外一種方法是雙熒光染色法：培養(yǎng)7 d后的內(nèi)皮祖細胞可行乙?；兔芏戎鞍?DIL- AC- LDL)和FITC標記的荊豆凝集I(FITC- UEA- I)的雙熒光染色鑒定,在激光聚焦顯微鏡下DIL- AC- LDL陽性細胞顯示的是紅色熒光(細胞內(nèi)吞作用),而FITC- UEA- I陽性細胞顯示的是綠色熒光(細胞膜結(jié)合表達),藍色的是細胞核,顯示黃色的雙熒光陽性細胞即為正在分化的內(nèi)皮祖細胞[12- 13]。

1.3 內(nèi)皮祖細胞的動員、分化和歸巢

人類內(nèi)皮祖細胞主要存在于骨髓中,外周血中含量很少,特別是冠心病、老年、吸煙、肥胖的患者,外周血內(nèi)皮祖細胞的數(shù)目更低[14- 15]。內(nèi)源性、外源性因素,如組織缺血缺氧、創(chuàng)傷、血管損傷、體育鍛煉、雌激素等因素可以使內(nèi)皮祖細胞動員至外周血中[16- 17]。研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以通過AKt信號通路促進內(nèi)皮祖細胞的增殖、動員、遷移,并通過上調(diào)血管內(nèi)皮祖細胞的整合素亞單位誘導黏附,從而參與損傷內(nèi)膜的修復[18]。Tan等[19]通過調(diào)查服用氯沙坦的冠心病患者外周血中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量以及內(nèi)皮改善功能,發(fā)現(xiàn)服用氯沙坦的患者外周血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量有所增加、內(nèi)皮功能有所改善,提示氯沙坦等ARB類藥物有可能通過動員內(nèi)皮祖細胞來改善內(nèi)皮功能。這些導致內(nèi)皮祖細胞數(shù)量增加的因素是通過產(chǎn)生和釋放內(nèi)皮祖細胞的相關細胞因子,包括基質(zhì)細胞衍生因子- 1(SDF1)、細胞內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、促紅細胞生成素(EPO)、集落形成刺激因子(G- CSF)、粒細胞集落形成刺激因子(GM- CSF)、白介素- 6(IL- 6)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP9)等[20- 23]。血管內(nèi)皮損失、組織缺氧等情況下可以誘導內(nèi)皮祖細胞歸巢至損失缺血部位,但目前為止內(nèi)皮祖細胞在體內(nèi)究竟如何分化為成熟內(nèi)皮細胞的機制尚不明確,在內(nèi)皮祖細胞動員中發(fā)揮重要作用的細胞因子在內(nèi)皮祖細胞分化、歸巢中同樣具有重要作用。

2 內(nèi)皮祖細胞在冠心病中的作用

動脈粥樣硬化是一組稱為動脈硬化性血管病中最常見、最重要的一種,其特點是動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小,由于在動脈內(nèi)膜上積聚的脂質(zhì)外觀呈黃色粥樣,因此稱為動脈粥樣硬化,累及心血管就稱為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病,特點是病變動脈有膽固醇、纖維化和炎癥細胞浸潤[24]。在冠心病治療過程中需要關注內(nèi)皮損傷和修復兩者之間的平衡。在生理條件下,完整的血管由一層內(nèi)皮細胞所覆蓋,內(nèi)皮細胞不僅負責血液和組織液的代謝交換,同時能合成和分泌多種生物活性物質(zhì),以保證血管正常的收縮和舒張,起到維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓以及凝血與抗凝平衡等特殊功能,進而保持血液的正常流動和血管的長期通暢,在血管受損的條件下內(nèi)皮祖細胞被誘導歸巢至受損血管區(qū)域,進而參與血管新生修復[25]。

2.1 內(nèi)皮祖細胞與血管新生

血管新生(angiogenesis)是指血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖,從原先存在的血管發(fā)芽形成新的血管,多見于糖尿病視網(wǎng)膜病變、腫瘤或者心肌梗死邊緣的毛細血管增生。缺血、應激、炎癥等病理刺激下內(nèi)皮祖細胞可以選擇性募集到受損或缺血區(qū)域,通過自身的分化、增殖從而形成新的血管,無需依賴原有的血管系統(tǒng)。2001年Kawamoto等[26]對下肢缺血小鼠模型進行內(nèi)皮祖細胞移植,4周后發(fā)現(xiàn)缺血肢體的血流量較對照組增加了42%,毛細血管數(shù)目也增加了1倍。同年,Kocher等[27]對心肌梗死小鼠模型進行了內(nèi)皮祖細胞移植,結(jié)果顯示在非心肌梗死區(qū)幾乎未發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞,而梗死區(qū)域觀察到大量的內(nèi)皮祖細胞參與了血管新生的形成,梗死部位的毛細血管數(shù)量也明顯增加,心肌凋亡、膠原沉積和瘢痕形成減少,左心室功能得到一定改善。2003年Werner等[28]通過靜脈將內(nèi)皮祖細胞注射到動脈損傷的小鼠模型體內(nèi),2周后免疫組化即發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞歸巢到受損部位,內(nèi)皮祖細胞移植組與對照組相比較,受損血管的內(nèi)皮覆蓋率為(86.4±5.0)%,明顯高于對照組的(71.3±6.0)%,該實驗證實了缺血可以誘導內(nèi)皮祖細胞歸巢至缺血受損部位,參與修復損傷血管。Kawamoto等[29]利用PCR技術(shù)在體外擴增內(nèi)皮祖細胞,隨后將內(nèi)皮祖細胞經(jīng)靜脈注射到缺血模型小鼠的冠狀動脈中,實驗結(jié)果表明缺血心肌附近新生血管增多,且左心功能得到一定恢復。

2.2 內(nèi)皮祖細胞與旁分泌

旁分泌(paracrine)是指細胞產(chǎn)生的激素或調(diào)節(jié)因子通過細胞間隙對鄰近的其他種類細胞起促進作用。內(nèi)皮祖細胞分泌的細胞因子如VEGF、HGF、SDF- 1等可以通過旁分泌作用促進血管形成,是內(nèi)皮祖細胞治療冠心病的重要機制。VEGF可以增加缺血缺氧組織的血管滲透性以及增加血漿蛋白的外滲,這樣形成的新細胞基質(zhì)有利于內(nèi)皮祖細胞的遷移和血管新生,此外VEGF還可以提高內(nèi)皮祖細胞的分裂、增生能力,進而促進損傷血管內(nèi)皮的修復。Yi等[30]將轉(zhuǎn)染有VEGF基因的內(nèi)皮祖細胞注入皮瓣,然后將皮瓣植入裸鼠背部皮膚缺損的區(qū)域,通過對照發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠皮瓣存活率以及血流恢復能力均顯著增加,可見,轉(zhuǎn)染有VEGF基因的內(nèi)皮祖細胞效果更佳。另有研究證實,VEGF可以協(xié)同SDF- 1共同促進內(nèi)皮祖細胞的遷移及分化[31]。前文所述,他汀類藥物可以通過AKt信號通路促進內(nèi)皮祖細胞的增殖、動員、遷移,這其中需要HGF的參與,有研究表明在冠狀動脈結(jié)扎模型中測得HGF濃度偏低,通過人為導入HGF基因可以明顯促進血管新生以及增加內(nèi)皮祖細胞數(shù)量[32]。在血管新生過程中,上述細胞因子通過作用于內(nèi)皮祖細胞而促進血管新生,該過程中又可以不斷刺激機體產(chǎn)生更多的細胞因子,但目前對于細胞因子的研究仍然比較有限,未來,細胞因子的作用將會被研究得更為透徹,而新的細胞因子也會被發(fā)現(xiàn),我們可以通過更為優(yōu)化的細胞因子組合來治療冠心病。

2.3 內(nèi)皮祖細胞與炎癥

炎癥是各種心血管疾病的病理生理學基礎,促炎細胞因子刺激內(nèi)皮細胞表面黏附分子的表達,是促進動脈粥樣硬化的開始,炎癥可以刺激VEGF等生長因子的生成[33],同時也可以刺激骨髓中內(nèi)皮祖細胞釋放入循環(huán)外周血中[34],從而參與組織修復。動物研究表明血管損傷后內(nèi)皮祖細胞被迅速動員起來,同時循環(huán)中VEGF水平也明顯升高[35]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素- 1β、粒細胞- 巨噬細胞集落刺激因子等炎癥因子[36- 38]均可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞的動員、分化及歸巢。研究發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定型冠心病患者中C反應蛋白的水平與內(nèi)皮祖細胞數(shù)量呈正比,表明在穩(wěn)定型冠心病患者中炎癥可以刺激內(nèi)皮祖細胞的動員[39]。另一方面,研究表明持續(xù)或者過度的炎癥反應可能會導致循環(huán)內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量減少[40],如心力衰竭患者體內(nèi)的循環(huán)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量就明顯減少?；A研究及臨床證據(jù)表明炎癥在內(nèi)皮祖細胞動員中發(fā)揮著雙重作用,輕度炎癥可以誘導內(nèi)皮祖細胞的動員,而持續(xù)、過度的炎癥作用卻相反,目前這種效應的調(diào)節(jié)機制尚不明確,可能與長期持續(xù)的刺激導致骨髓內(nèi)皮祖細胞池耗竭,最終釋放不成熟或者不正常的內(nèi)皮祖細胞有關,現(xiàn)在需要進一步的實驗來闡述其中的相關機制。

2.4 內(nèi)皮祖細胞與預防支架內(nèi)再狹窄

隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入手術(shù)的廣泛開展,術(shù)后急性支架內(nèi)血栓和再狹窄目前仍沒有很好的預防和治療方案,是急需引起我們關注和解決的臨床問題。植入表面包被內(nèi)皮祖細胞抗體的涂層支架是否能很好地解決這一問題,目前已經(jīng)是內(nèi)皮祖細胞研究的一大熱點。有實驗證明,植入表面包被CD34抗體的涂層支架可以防止由于支架植入處內(nèi)皮損傷導致的再狹窄等一系列并發(fā)癥[41]。Aoki等[42]于2005年首次在臨床上植入表面包被CD34抗體的涂層支架,經(jīng)過為期9個月的隨訪觀察,發(fā)現(xiàn)16例參加實驗的患者中只有1例患者出現(xiàn)心腦血管事件,經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)超聲顯示支架再狹窄面積只占支架的(27.2±20.9)%,該臨床研究證實應用此類支架是安全有效的,這就為內(nèi)皮祖細胞在冠心病介入治療領域的應用提供了新的思路。

3 總結(jié)和展望

綜上所述,作者對內(nèi)皮祖細胞的生物學特性、內(nèi)皮祖細胞與血管新生、內(nèi)皮祖細胞與炎癥、內(nèi)皮祖細胞與預防支架內(nèi)再狹窄進行了簡單的闡述,通過某些藥物或者體外擴增內(nèi)皮祖細胞再移植等多種方法均可以增加冠心病患者外周血中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量及功能,促使內(nèi)皮祖細胞歸巢至缺血部位,促進損傷血管新生以及預防支架內(nèi)再狹窄等,為冠心病的治療開拓了新的前景。但是目前仍有許多問題有待解決：首先我們是否能找到內(nèi)皮祖細胞表面特異性抗原標志物,從而將內(nèi)皮祖細胞與其他外周血細胞很好地區(qū)別開來；其次如何在體外有效地分離純化、培養(yǎng)、擴增內(nèi)皮祖細胞,然后內(nèi)皮祖細胞在體內(nèi)動員、分化、歸巢的信號通路以及參與其中的細胞因子尚不清楚；最后現(xiàn)階段關于內(nèi)皮祖細胞的研究還停留在動物實驗階段,缺乏大量的臨床資料來證實其可行性。盡管目前還存在以上諸多問題,我們有理由相信內(nèi)皮祖細胞能在不久的將來應用到冠心病的臨床治療中。

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