張振濤 張國(guó)新 王洪財(cái) 熊 婧 胡 丹 張兆輝

帕金森病(Parkinsondisease，PD)是最常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病之一，最典型的臨床表現(xiàn)是靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)步態(tài)障礙等運(yùn)動(dòng)癥狀，PD運(yùn)動(dòng)癥狀的病理基礎(chǔ)是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性缺失。但是迄今為止多巴胺能神經(jīng)元損傷的確切機(jī)制尚未闡明［1］。有研究發(fā)現(xiàn)帕金森病發(fā)病過(guò)程中鈣蛋白酶活性增強(qiáng)，但其在多巴胺能神經(jīng)元損傷中的作用尚不明確［2］。本研究利用MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡為模型，觀察了鈣蛋白酶在帕金森病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

鈣蛋白酶抗體和MDL28170購(gòu)自Calbiochem公司，MTT和神經(jīng)生長(zhǎng)因子購(gòu)自Sigma公司，ALLN購(gòu)自SantaCruz公司，鈣蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系(PC12細(xì)胞)由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物儲(chǔ)藏中心提供。

1.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

PC12細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml，于5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液;藥物處理前l(fā)周用NGF(終濃度為0.1μg/ml)誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞神經(jīng)元樣分化。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

調(diào)節(jié)細(xì)胞密度約2×105/ml，以100μl/孔接種于96孔板，分別加入75mmol/L的MPP+處理2、4、8和12h，每種處理設(shè)立6個(gè)復(fù)孔，每孔加5mg/ml MTT10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h;棄培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜100μl，37℃孵育20min，至顆粒溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm的吸光度值，將其作為反映PC12細(xì)胞活性和代謝狀況的參數(shù)。細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

PC12細(xì)胞經(jīng)MPP+處理后24h收獲細(xì)胞，以4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，取100μl細(xì)胞懸液 加入5μlAnnexin-FITC和10μl20pg/mlPI溶液，混勻后室溫避光孵育15min，加入400μlPBS，流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析與早期凋亡細(xì)胞檢測(cè)。

1.5 免疫印跡法

PC12細(xì)胞經(jīng)處理后收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液后在冰上裂解，1300r/mm離心10min，取上清液，測(cè)定蛋白濃度后聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，然后用鈣蛋白酶抗體4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育后顯色、曝光。

1.6 鈣蛋白酶活性檢測(cè)

根據(jù)鈣蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，細(xì)胞處理后使用裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清液，蛋白定量后取100μg蛋白，加入10μl10×反應(yīng)緩沖液和5 μl鈣蛋白酶底物，37℃避光反應(yīng)1h，然后使用400 nm激發(fā)波長(zhǎng)、505nm發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)均用ˉx±s表示，采用SPSS軟件，采用單因素方差分析(ANOVA)中的SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 MPP+對(duì)鈣蛋白酶表達(dá)水平的影響

在MPP+處理不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，免疫印跡發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元樣分化的PC12細(xì)胞經(jīng)75mmol/L MPP+處理后總鈣蛋白酶水平無(wú)明顯變化，但活化的鈣蛋白酶水平顯著增高。活化的鈣蛋白酶水平在MPP+處理后時(shí)間依賴性增高，12h后達(dá)到對(duì)照組的3.22倍(圖1)。

圖1 MPP+對(duì)鈣蛋白酶表達(dá)水平的影響 A為免疫印跡;B為灰度值變化;與對(duì)照組比較，*P＜0.05

2.2 MPP+、ALLN和MDL28170對(duì)鈣蛋白酶活性的影響

MPP+處理后蛋白酶活性呈時(shí)間依賴性增高，并一直持續(xù)到12h。鈣蛋白酶抑制劑ALLN(50 μmol/L)和MDL28170(10μmol/L)能夠顯著抑制MPP+誘導(dǎo)的鈣蛋白酶活化(圖2)。

圖2 MPP+對(duì)鈣蛋白酶活性的影響 與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與MPP+12h組比較，#P＜0.05

2.3 鈣蛋白酶抑制劑對(duì)細(xì)胞活力的影響

75mmom/LMPP+處理12h后細(xì)胞活力降至對(duì)照組的57.25%，鈣蛋白酶抑制劑ALLN(50μmol/L)處理組細(xì)胞活力升高到對(duì)照組的79.25%，而MDL28170(10μmol/L)處理組細(xì)胞活力也升高到對(duì)照組的73.5%(P＜0.05)(圖3)。

圖3 鈣蛋白酶抑制劑對(duì)細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與MPP+組比較，#P＜0.05

2.4 鈣蛋白酶抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響75 mmom/LMPP+處理12h后細(xì)胞凋亡率升高22.3%，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而鈣蛋白酶抑制劑ALLN(50μmol/L)和MDL28170(10μmol/L)均顯著降低MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷(P＜0.05)(圖4)。

圖4 鈣蛋白酶抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與MPP+組比較，#P＜0.05

3 討論

迄今為止，帕金森病多巴胺能神經(jīng)元損傷的確切機(jī)制尚未闡明，也沒(méi)有針對(duì)發(fā)病機(jī)制的治療方法。因此尋找參與多巴胺能神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵分子是目前帕金森病發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。既往研究發(fā)現(xiàn)，遺傳和環(huán)境因素會(huì)導(dǎo)致一系列病理生理變化，如氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、蛋白異常折疊等，但這些因素如何進(jìn)一步導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷并不明確［3］。本研究使用MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡為模型，觀察了鈣蛋白酶在多巴胺能神經(jīng)元損傷中的作用。

MPP+是MPTP的活性代謝產(chǎn)物，MPTP可誘導(dǎo)人類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物出現(xiàn)類(lèi)似帕金森病的臨床表現(xiàn)。MPTP在體內(nèi)被代謝為MPP+，MPP+通過(guò)神經(jīng)元表面的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞后損傷線粒體復(fù)合物Ⅰ的功能，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷［4］。PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，經(jīng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后具備某些神經(jīng)元的特性，如停止分裂、生長(zhǎng)出神經(jīng)元樣突起等［5］，因此常用其制作帕金森病細(xì)胞模型［6，7］。本研究使用MPP+處理神經(jīng)元樣分化的PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)處理后細(xì)胞活力顯著下降，因此我們使用該模型作為帕金森病神經(jīng)元損傷的體外模型，探尋導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵分子機(jī)制。

鈣蛋白酶是身體各組織廣泛存在的一種蛋白酶，既往研究發(fā)現(xiàn)它參與體內(nèi)一系列重要的生理和病理過(guò)程，其發(fā)揮活性需要鈣離子的參與［8，9］。目前為止并未發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶對(duì)其底物蛋白的切割需要特定的氨基酸序列，也未明確其識(shí)別底物的方式。既往研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶切割一系列底物蛋白，如tau蛋白、TDP-43蛋白等，參與阿爾茨海默病和肌萎縮側(cè)索硬化的發(fā)病過(guò)程［10～12］，但其在帕金森病中的作用并不明確。本研究發(fā)現(xiàn)MPP+處理4h后PC12細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶蛋白表達(dá)水平開(kāi)始增高，到12h蛋白水平升高到對(duì)照組的3.7倍。鈣蛋白酶由催化亞基與調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成。除了細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平外，鈣蛋白酶活性還受到細(xì)胞內(nèi)固有的鈣蛋白酶抑制劑的調(diào)控［13］。

為了明確鈣蛋白酶蛋白水平增高是否會(huì)導(dǎo)致其活性增高，我們直接使用鈣蛋白酶的熒光底物檢測(cè)了鈣蛋白酶的活性水平，發(fā)現(xiàn)MPP+處理后鈣蛋白酶活性呈時(shí)間依賴性增高。

為了明確鈣蛋白酶活性增高是神經(jīng)元損傷的原因還是其結(jié)果，我們使用兩種不同的鈣蛋白酶抑制劑ALLN和MDL28170處理PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者均能有效抑制鈣蛋白酶活性，同時(shí)ALLN和MDL281780都能夠明顯抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，提示鈣蛋白酶活性增高在多巴胺能神經(jīng)元損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而不是神經(jīng)元損傷的后續(xù)結(jié)果，阻斷鈣蛋白酶通路可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。

鑒于鈣蛋白酶底物眾多，目前尚不明確它通過(guò)切割那些底物參與多巴胺能神經(jīng)元損傷，但有研究發(fā)現(xiàn)α-突觸核蛋白是鈣蛋白酶的底物［14］。α-突觸核蛋白是帕金森病患者路易體的主要成分，經(jīng)鈣蛋白酶切割后α-突觸核蛋白片段更容易形成聚集體［15］，因此本研究推測(cè)鈣蛋白酶可能是通過(guò)切割α-突觸核蛋白發(fā)揮神經(jīng)損傷作用的。另外，鈣蛋白酶還可以切割tau蛋白，而tau蛋白可與α-突觸核蛋白相互作用，促進(jìn)包涵體的產(chǎn)生［16］。鈣蛋白酶還作用于突觸相關(guān)蛋白，影響神經(jīng)元功能［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，在α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠中過(guò)表達(dá)鈣蛋白酶特異性抑制劑能夠抑制α-突觸核蛋白聚集，保護(hù)突觸功能，減輕膠質(zhì)細(xì)胞活性［18］。在肌萎縮側(cè)索硬化模型小鼠中抑制蛋白酶功能也能夠改善小鼠的病理學(xué)改變［12］。結(jié)合本研究的發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為鈣蛋白酶在帕金森病的發(fā)病中可能起到重要的作用，并有可能成為帕金森病的治療靶點(diǎn)。由于鈣蛋白酶有其生理作用，廣泛抑制鈣蛋白酶可能會(huì)產(chǎn)生全身副作用，但如果能夠明確帕金森病多巴胺能神經(jīng)元損傷過(guò)程中鈣蛋白酶的主要底物，就可以采取某些策略選擇性抑制鈣蛋白酶對(duì)其底物的病理性切割，這對(duì)帕金森病的治療可能具有重要的意義。

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