梁 慧 文國(guó)強(qiáng)

腦出血發(fā)生率在近些年來(lái)呈現(xiàn)著逐年上升的趨勢(shì)，目前認(rèn)為成熟腦組織結(jié)構(gòu)和功能具有一定的可塑性，腦出血后促進(jìn)神經(jīng)再生現(xiàn)已成為治療神經(jīng)元損傷的途徑之一，故腦損傷后神經(jīng)保護(hù)因子的分泌已成為腦血管疾病的研究熱點(diǎn)。BDNF是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的蛋白質(zhì)，對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、分化及生存起著重要作用，且能防止神經(jīng)細(xì)胞受損死亡，存活受損神經(jīng)細(xì)胞再生及分化［1］。NGB是一種主要在腦組織中表達(dá)的攜氧蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)其在缺血、缺氧條件下表達(dá)升高且對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)缺血、缺氧具有十分重要的神經(jīng)保護(hù)功能［2］。安腦丸是在傳統(tǒng)中藥安宮牛黃丸基礎(chǔ)上重新組方而成的一種新藥，已有研究表明其對(duì)急性腦卒中所引起的竅閉、抽搐痙厥有明顯療效［3］，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)采用膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型，用安腦丸治療模型大鼠，通過(guò)觀察其治療后的學(xué)習(xí)記憶能力、血腫周?chē)鶥DNF mRNA及NGB的表達(dá)來(lái)探討安腦丸改善腦出血模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制，為臨床治療腦出血奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取健康成年雄性Sprague－Dawley大鼠40只，體重（220±20）g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部所提供，并隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組及安腦丸組，每組各10只。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和器材

Ⅶ型膠原酶（collagenaseⅦ）：美國(guó)sigma公司；Stoelting TL－2型鼠腦立體定位儀：Biolegend公司；安腦丸：哈爾濱蒲公英藥業(yè)有限公司；Morris水迷宮，Ethovision系統(tǒng)：荷蘭Noldus公司；Trizol：Invitrogen公司；PCR反應(yīng)體系內(nèi)其他試劑：碧云天生物技術(shù)研究所；熒光定量PCR儀（7700型）：美國(guó)ABI公司；兔抗大鼠NGB多克隆抗體：北京欣博盛生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及給藥 采用Rosenberg方法制作大鼠腦出血模型［4］。模型組及安腦丸組制作腦出血模型；正常組不做任何處理；假手術(shù)組中除用無(wú)菌生理鹽水替代Ⅶ型膠原酶注射入蒼白球外，其余操作均同模型組與安腦丸組。安腦丸在大鼠手術(shù)2 h清醒后開(kāi)始給予安腦丸灌胃（1 g／kg），2次／d，連續(xù)給予7 d，模型組及假手術(shù)組灌于同等量的生理鹽水。

1.3.2 模型成功評(píng)價(jià) 手術(shù)大鼠清醒后按Zea Longa法評(píng)定大鼠神經(jīng)功能缺損情況［5］。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：不能完全伸展出血對(duì)側(cè)前肢；2分：向出血對(duì)側(cè)追尾轉(zhuǎn)圈；3分：向出血對(duì)側(cè)傾倒；4分：意識(shí)障礙，不能自發(fā)行走。將評(píng)分在1－3分之間者納為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其余給予剔除，并同時(shí)給予相應(yīng)的補(bǔ)充。

1.3.3 測(cè)定血腫周?chē)鶥DNF mRNA表達(dá)水平 各組大鼠于連續(xù)治療7 d后各取5只采用過(guò)量10%水合氯醛麻醉后，快速斷頭取腦，剝離出少許血腫周?chē)M織，總RNA提取按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。選擇紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度與純度。運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA分子，反應(yīng)體積為10μl，在37℃下孵育15 min，85℃下5 s以終止反應(yīng)及滅活反轉(zhuǎn)錄酶，將管家基因GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行質(zhì)控及標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)獲得的條帶行灰度值分析。BDNF上游引物序列：5’－GTCCCTTCTACACTTTACCTCTTG－3’；下 游 引 物 序 列：5’－CTTTGTTTCACCCTTTCCACTCCT－3’；內(nèi) 參GAPDH上 游 引 物 序 列：5’－CACGGCAAGTTCAACGGCACAG－3’；下游引物序列：5’－ACGCCAGTAGACTCCACGACAT－3’。

1.3.4 免疫組化法檢測(cè)血腫周?chē)鶱GB陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)水平 各組大鼠在治療7 d后各取5只用10%水合氯醛麻醉，采用4%多聚甲醛溶液灌注固定，待大鼠軀體變硬后斷頭取腦，固定于同樣4%多聚甲醛后，分別先后置入20%、30%蔗糖溶液中，待組織沉底后放入恒冷切片機(jī)進(jìn)行切片，保存?zhèn)溆?；滴加正常山羊血清封閉，室溫下放置30 min；滴加兔抗NGB一抗50μl，4℃下孵育24 h；加相應(yīng)的生物素二抗，室溫下孵育30 min；滴加SABC試劑，30℃下孵育30 min，加新鮮配制的二甲苯聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑，顯微鏡下控制顯色時(shí)間；常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片；光鏡下觀察、拍照并記錄。

1.3.5 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定 采用Morris水迷宮法檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶能力［6］。水迷宮裝置參數(shù)：直徑為120 cm，圓形逃逸平面直徑為10 cm，高為40 cm，用黑色塑料袋將其纏繞后放于第三象限中間，平臺(tái)低于水面2 cm，水池溫度控制在（25±2）℃，用碳素墨水將水池中水染黑；水池周?chē)鷧⒄瘴锉３植蛔?，分別從四個(gè)象限將大鼠放入水池中，等待其找到目標(biāo)平臺(tái)；假如大鼠在60 s內(nèi)尋找到目標(biāo)平臺(tái)且在平臺(tái)上停留15 s后將其撈起，記錄其從象限出發(fā)點(diǎn)到找著目標(biāo)平臺(tái)的時(shí)間，則為逃避潛伏期（escapse latency，EL）；假如大鼠在60 s內(nèi)無(wú)法找到目標(biāo)平臺(tái)，則用竹棍將其引導(dǎo)至平臺(tái)，待其停留在平臺(tái)上15 s后撈起，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)記憶，則此時(shí)的EL為60 s；用上述方法連續(xù)訓(xùn)練5 d后記錄第6d的時(shí)間均值，并將其作為觀察指標(biāo)來(lái)測(cè)定學(xué)習(xí)能力，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程是由計(jì)算機(jī)來(lái)記錄各種參數(shù)。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間差異采用單因素方差分析，2組間方差齊者用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血腫周?chē)鶥DNF mRNA的表達(dá)水平

正常組與假手術(shù)組BDNF mRNA表達(dá)水平的差異不明顯（P＞0.05）；模型組及安腦丸組BDNF mRNA表達(dá)較正常組及假手術(shù)組均明顯增多（P均＜0.01）；安腦丸組BDNF mRNA表達(dá)明顯多于模型組（P＜0.01）（表1）。

2.2 大鼠血腫周?chē)鶱GB陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)水平

正常組及假手術(shù)組腦組織存在少量的NGB陽(yáng)性細(xì)胞；模型組及安腦丸組較正常組及假手術(shù)組NGB陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多（P均＜0.01）；安腦丸組的NGB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)又較模型組顯著增加（P＜0.01）（表1，圖1）。

2.3 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)

正常組與假手術(shù)組間逃避潛伏期無(wú)明顯差異（P＞0.05）；模型組及安腦丸組較正常組及假手術(shù)組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P均＜0.01）；安腦丸組較模型組逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01）（表1）。

表1 各組大鼠血腫周?chē)鶥DNF mRNA、NGB陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)及逃避潛伏期（ˉx±s，n＝10）

圖1 免疫組化檢測(cè)血腫周?chē)鶱GB陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)水平（DAB×200倍） A為模型組；B為安腦丸組

3 討 論

腦出血是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，其病死率、致殘率都較高，約占腦血管疾病的17.2%～56%。腦出血后造成神經(jīng)系統(tǒng)的損傷導(dǎo)致軸突無(wú)法有效再生，因此往往造成了神經(jīng)系統(tǒng)不可逆性的功能喪失而遺留很多后遺癥，其中學(xué)習(xí)記憶功能的減退是其常見(jiàn)的后遺癥之一，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，給患者及家庭甚至社會(huì)均帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［7，8］。故探討有效的治療方法與促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)成為了當(dāng)前神經(jīng)學(xué)界研究的重點(diǎn)。

目前Morris水迷宮已被廣泛用于檢測(cè)動(dòng)物記憶行為學(xué)，其中定位航行實(shí)驗(yàn)是通過(guò)記錄被測(cè)試動(dòng)物每次的逃避潛伏期來(lái)反映動(dòng)物對(duì)目標(biāo)平臺(tái)空間位置的記憶能力，從而評(píng)估動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。逃避潛伏期的長(zhǎng)短是與動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力成反比。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明安腦丸治療可促進(jìn)腦出血大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，而其具體的作用機(jī)制目前還不十分清楚。

腦紅蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的和血紅蛋白與肌紅蛋白為同一蛋白家族的第三類(lèi)重要的攜氧蛋白。大量研究表明在缺血、缺氧狀態(tài)下NGB mRNA的表達(dá)明顯增加，說(shuō)明在腦缺血缺氧損傷中NGB能對(duì)神經(jīng)元起到重要的保護(hù)作用［9，10］。與肌紅蛋白相似，NGB在缺氧狀態(tài)下可促進(jìn)氧氣向線(xiàn)粒體內(nèi)彌散，從而提高氧的利用［11］。目前認(rèn)為NGB可能是通過(guò)以下途徑對(duì)缺血缺氧神經(jīng)元起到保護(hù)作用：一是通過(guò)清除活性的氧自由基與氮自由基，從而減輕其對(duì)細(xì)胞的毒性作用；二是通過(guò)協(xié)助神經(jīng)細(xì)胞的需氧代謝，從而協(xié)助氧氣從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散至線(xiàn)粒體內(nèi)；三是通過(guò)調(diào)節(jié)某G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而減少線(xiàn)粒體機(jī)能障礙與細(xì)胞凋亡，從而提高細(xì)胞存活率。本實(shí)驗(yàn)觀察到接受安腦丸治療后的腦出血大鼠血腫周?chē)鶱GB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于模型組（P＜0.01），因此本研究推測(cè)安腦丸可通過(guò)促進(jìn)腦出血血腫周?chē)M織NGB表達(dá)來(lái)發(fā)揮其改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)腦出血血腫周?chē)鶥DNF mRNA的表達(dá)水平亦較模型組明顯升高（P＜0.01）。

在腦組織中BDNF主要是由神經(jīng)細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞合成釋放的，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能產(chǎn)生及維持起著重要作用［12］。在腦組織損傷后BDNF可通過(guò)穩(wěn)定鈣離子濃度、增強(qiáng)抗氧化酶活性及減輕自由基損傷、減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元再生等方面而促進(jìn)損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)。在病理狀態(tài)下如缺血、缺氧等損傷后可誘導(dǎo)腦組織中BDNF mRNA和蛋白表達(dá)明顯增多［13］，這與本實(shí)驗(yàn)所觀察到的結(jié)果一致。

由此，本研究推測(cè)安腦丸治療可通過(guò)促進(jìn)腦出血血腫周?chē)鶱GB、BDNF表達(dá)的增加，進(jìn)而修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞來(lái)改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。關(guān)于安腦丸改善腦出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制極其復(fù)雜，目前仍然存在著許多問(wèn)題，因此仍有待進(jìn)一步的深入研究。

1 Schabitz WR，Berger C，Kollmar R，et al.Effect of brain derived neurotrophic factor arm use on functional motor recovery after small cortical ischemia.Stroke，2004，35（4）：992－997.

2 Li RC，Guo SZ，Lee SK，et al.Neuroglobin protects neurons against oxidative stress in global ischemia.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30（11）：1874－1882.

3 王素秋，李 恬，宋世偉，等.安腦丸的臨床應(yīng)用及觀察分析.中國(guó)中醫(yī)急癥，1993，2（4）：153－154.

4 Rosenberg GB.Collgenose－induced intracerebral hemorrhage in rat.Stroke，1990，21（5）：801.

5 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20（1）：84－91.

6 胡鏡清，溫澤淮，賴(lài)世隆，等.Morris水迷宮檢測(cè)的記憶屬性與方法學(xué)初探.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17（2）：117－120.

7 Zhao C，F(xiàn)ancy SP，Kotter MR，et al.Mechanisms of CNS remyelination：The key to therapeutic advances.Neurol Sci，2005，233（1－2）：87－91.

8 Lee JC，Cho GS，Choi BO，et al.Intracerebral hemorrhage－induced brain injury is aggravated in senescence－accelerated prone mice.Stroke，2006，37（1）：216－222.

9 XI G H，HUA Y，RICHARD F K，et al.Systemic complement depletion diminishes perihematomal brain edema in rats.Stroke，2001，32（1）：162－167.

10 Wang X，Liu J，Zhu H，et al.Effects of neuroglobin overexpression on acute brain injury and long－term outcomes after focal cerebral ischemia.Stroke，2008，39（6）：1869－1874.

11 Sun Y，Jin K，Mao XO，et al.Neuroglobin is up－regulated by and protects neurons from hypoxic－ischemic injury.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（26）：15306－15311.

12 Conture M.Bumester T，Hankeln T，et al.The heme environment of mouse neuroglobin.Evidence for presence of two conformations of the heme pocket.J Biol Chem，2001，276（39）：36377－36382.

13 Mattson MP，Lovell MA，F(xiàn)urukawa K，et al.Neurotrophic factors attenuate glutamate－induced accumulation of peroxides，elevation of intracellular Ca2＋concentration，and neurotoxicity and increase antioxidant enzyme activities in hippocampal neurons.J Neurochem，1995，65（4）：1740－1751.14 Kiprianova I，F(xiàn)reiman TM，Desiderato S，et al.Brain－derived neurotrophic factor prevents neuronal death and glial activation after globalischemia in the rat.J Neurosci Res，1999，56（1）：21－27.