周發(fā)明 李小麗 陳光輝

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病。研究表明IL－23／IL－17軸在MS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［1］。IL－17是IL17家族的代表性因子，能誘導(dǎo)多種致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)MS早期即出現(xiàn)軸索損傷［2］，這可能是MS患者反復(fù)發(fā)作后部分神經(jīng)功能無法完全恢復(fù)的原因。β－APP是軸索損害的一個(gè)敏感指標(biāo)［3］，通過對(duì)β－APP的檢測(cè)可以判斷軸索損傷的程度和范圍，保護(hù)MS的軸索損傷已成為主要的研究方向。雷公藤多甙已在臨床廣泛運(yùn)用于治療免疫性疾病，但雷公藤多甙對(duì)EAE大鼠的保護(hù)作用機(jī)制如何，相關(guān)報(bào)道并不多見。本研究通過雷公藤多甙對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）大鼠進(jìn)行干預(yù)，并對(duì)大鼠的發(fā)病率、發(fā)病后神經(jīng)功能評(píng)分、中樞神經(jīng)組織病理變化以及β－APP、IL－17等指標(biāo)進(jìn)行研究分析，以探討雷公藤多甙對(duì)EAE作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 6～8周齡雌性Wistar大鼠30只，體重約180～200 g（學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）?？ń槊鐑龈煞圪徸陨虾Ｉ镏破费芯克籌L－17試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；兔抗大鼠β－APP多克隆抗體購自北京中杉金橋；SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；雷公藤多甙片（TWP）為黃石飛云制藥有限公司生產(chǎn)（Z42021312）。

1.2 EAE模型的建立及評(píng)分 等量的豚鼠脊髓勻漿和含8 mg／ml卡介苗的完全福氏佐劑（CFA）混合為免疫抗原，Wistar大鼠按0.5 ml／只分別于大鼠后足墊及背部皮下注射免疫抗原，誘導(dǎo)EAE模型［4］。于豚鼠免疫后每天對(duì)豚鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。采用Hooper的7分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，即0分：正常；1分：被毛不光整，尾部無力；2分：尾部癱瘓；3分：尾部癱瘓＋后肢無力；4分：尾部癱瘓＋后肢部分癱瘓；5分：后肢完全癱瘓；6分：四肢癱瘓；7分：瀕死狀態(tài)或死亡［5］。

1.3 分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分成3組即（1）空白對(duì)照組（CON組，n＝10）：相同條件和環(huán)境中飼養(yǎng)，不作任何處理，用于反映正常生理狀態(tài)；（2）模型組（EAE組，n＝10）：使用豚鼠脊髓勻漿與CFA混合抗原乳劑誘導(dǎo)大鼠建立EAE模型，并予生理鹽水1.5 ml／只灌胃，1次／d，連續(xù)14 d；（3）治療組（TWP組，n＝10）：使用豚鼠脊髓勻漿與CFA混合抗原乳劑誘導(dǎo)大鼠建立EAE模型，將雷公藤多甙片溶于生理鹽水中，以劑量20 mg／kg灌胃，1次／d，連續(xù)14 d。

1.4 HE染色 于建模后14 d（此時(shí)接近EAE模型發(fā)病的高峰期）處死大鼠，取脊髓中腰膨大部分，放入4%多聚甲醛固定，制成石蠟切片，蘇木素－伊紅（HE）染色，將切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，觀察組織中血管周圍炎性細(xì)胞浸潤情況，并記數(shù)血管周圍袖套數(shù)目，3張切片上血管袖套數(shù)目取平均值（病理評(píng)分）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)液修復(fù)等行β－APP、IL－17免疫組織化學(xué)染色。結(jié)合HE染色，將免疫組織化學(xué)染色完畢的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，按順序計(jì)數(shù)每張切片脊髓內(nèi)5個(gè)400倍視野下陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，細(xì)胞的表達(dá)以該片陽性細(xì)胞數(shù)／5表示，然后取3張切片的平均值表示該組表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，2組間計(jì)量資料比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠發(fā)病情況及神經(jīng)功能評(píng)分 空白對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常，無1例出現(xiàn)EAE癥狀；大鼠造模后EAE組第9 d開始發(fā)?。籘WP組第11 d開始發(fā)病。發(fā)病大鼠均以尾部遠(yuǎn)端張力下降、爬行時(shí)尾尖下垂為首發(fā)癥狀，繼而出現(xiàn)步態(tài)搖擺，進(jìn)而出現(xiàn)全尾癱瘓、拖地，后肢無力、癱瘓等癥狀，部分合并前肢癱瘓，甚至瀕死。CON組大鼠平均神經(jīng)功能評(píng)分為0，無臨床癥狀。EAE組與TWP組2組間發(fā)病率和潛伏期無明顯差異。TWP組較EAE組平均神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠EAE發(fā)病情況

2.2 大鼠脊髓HE染色

CON組大鼠脊髓HE染色均勻，無炎性細(xì)胞浸潤（圖1）；EAE組大鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)炎性灶多見，以小血管為中心并可見中心小血管擴(kuò)張，管周由大量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主，也可見膠質(zhì)細(xì)胞及一定數(shù)量的巨嗜細(xì)胞浸潤環(huán)繞，形成“袖套”樣改變（圖2），病理評(píng)分為（2.09±0.91）分。TWP組炎性細(xì)胞浸潤及血管“袖套”明顯減少，病理評(píng)分為（1.05±0.36）分。TWP組病理評(píng)分較EAE組降低（P＜0.05）。

2.3 大鼠脊髓β－APP、IL－17表達(dá)水平

各組內(nèi)均可見明顯陽性細(xì)胞表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞漿著色，呈黃褐或黃色，不均勻散在分布。與EAE組比較（表2，圖3～6），TWP組大鼠組織中β－APP、IL－17表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠β－APP、IL－17的表達(dá)水平（ˉx±s，個(gè)／每400倍視野）

圖1 CON組大鼠腰髓，未見炎癥細(xì)胞浸潤（HE染色×100倍） 圖2 EAE組第14 d大鼠腰髓，炎癥細(xì)胞浸潤，血管袖套形成（HE染色×100倍）

圖3 EAE組β－APP表達(dá)水平（×400倍） 圖4 TWP組β－APP表達(dá)水平（×400倍）

圖5 EAE組IL－17表達(dá)水平（×400倍） 圖6 TWP組IL－17表達(dá)水平（×400倍）

3 討 論

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）與人類多發(fā)性硬化（M S）的病理變化極其相似，是研究多發(fā)性硬化的經(jīng)典動(dòng)物模型，其病因、發(fā)病機(jī)制目前仍不十分明確。近來研究表明IL－23／IL－17軸在MS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。IL－17是由IL－23誘導(dǎo)生成的Thl7細(xì)胞分泌，IL－17家族的代表性因子，能誘導(dǎo)多種致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL－6、腫瘤壞死因子1和一氧化氮合酶等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。有研究在EAE發(fā)病前檢測(cè)外周淋巴細(xì)胞內(nèi)即有顯著升高，發(fā)病高峰期外周淋巴細(xì)胞內(nèi)IL－17表達(dá)不明顯，但在CNS中可以檢測(cè)到高水平的IL－17生成，可能是由于發(fā)病高峰期Thl7細(xì)胞主要轉(zhuǎn)移至CNS所致［6］。梁軍利等的研究檢測(cè)到復(fù)發(fā)緩解型MS（RR－MS）患者血清和腦脊液IL－17水平較神經(jīng)系統(tǒng)非炎癥疾病患者明顯增高，提示IL－17與MS的發(fā)病密切相關(guān)［7］。Kebir等發(fā)現(xiàn)MS患者血腦屏障（BBB）內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL－17和IL－22受體，并且體內(nèi)外IL－17和IL－22均可以誘導(dǎo)BBB內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CCL2，CCL2與Thl7細(xì)胞表面相應(yīng)的趨化因子受體結(jié)合后破壞緊密連接，有效地通過BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也參與誘導(dǎo)EAE的發(fā)生［8］。在IL－17基因敲除小鼠對(duì)EAE不敏感，表現(xiàn)為發(fā)病延遲且恢復(fù)更早，EAE嚴(yán)重程度評(píng)分和病理改變都明顯減輕［9］，提示IL－17在MS（和EAE）的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。

近來對(duì)MS研究發(fā)現(xiàn)，單純的炎癥和脫髓鞘已經(jīng)不能完全解釋患者的神經(jīng)功能障礙，在MS早期以炎癥反應(yīng)為主的階段非脫髓鞘損害就已存在，而后者是MS功能障礙進(jìn)展的重要原因［10］。軸索損傷是影響患者治療和康復(fù)的重要因素，軸索損害越重MS患者的預(yù)后越差［11］。越來越多的證據(jù)支持軸索損傷在多發(fā)性硬化中的重要性，目前軸索損傷的依據(jù)主要來自于病理學(xué)和神經(jīng)影像學(xué)兩個(gè)方面。在病理學(xué)方面Trapp的研究結(jié)果表明，在MS發(fā)病過程中不僅發(fā)生了脫髓鞘改變，軸索也受到了損傷［12］。Amold通過MRI研究發(fā)現(xiàn)，一些MS患者的神經(jīng)元軸突方向上有一種非炎癥性的病理損害，表明與炎性細(xì)胞浸潤、脫髓鞘無關(guān)的神經(jīng)損害機(jī)制可能參與了MS的發(fā)病［13］。只有軸突甚至神經(jīng)元受到損害才能解釋這些不可逆的神經(jīng)障礙，所以可能存在某種有害因素繞過了髓鞘而直接損害神經(jīng)元。β－淀粉樣前體蛋白（β－Amyloid Precursor Proteinβ－APP）是一種廣泛存在于全身組織，具有膜受體蛋白樣結(jié)構(gòu)的單跨膜蛋白。β－APP作為軸索損害的一個(gè)敏感指標(biāo)，通過對(duì)β－APP的檢測(cè)可以判斷軸索損傷的程度和范圍。據(jù)報(bào)道用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)多發(fā)性硬化病變組織的β－APP進(jìn)行了檢測(cè)，表明急性多發(fā)性硬化、慢性活動(dòng)期等病變組織有較多的β－APP沉積，因?yàn)樵缙谳S突的軸漿運(yùn)輸功能障礙導(dǎo)致β－APP的沉積［14］，以上結(jié)果表明從定性定量的角度證實(shí)在EAE中確實(shí)存在軸索損傷，且隨病情活動(dòng)β－APP的表達(dá)量呈動(dòng)態(tài)變化。國內(nèi)也有研究表明，EAE模型組大鼠中樞β－APP蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［15］。Ghosh等通過免疫染色檢測(cè)β－App已經(jīng)在MS急性脫髓鞘病灶中證實(shí)存在實(shí)質(zhì)性軸索損傷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在部分其他急性脫髓鞘疾病中也會(huì)出現(xiàn)相同情況［16］。軸突的損傷與浸潤的CD8＋的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞有關(guān)。Owens等人發(fā)現(xiàn)MS早期廣泛軸突損傷的范圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)CD8＋T淋巴細(xì)胞的數(shù)量存在相關(guān)關(guān)系［17］。提示在強(qiáng)調(diào)由炎癥引發(fā)的髓鞘脫失導(dǎo)致繼發(fā)的神經(jīng)元損害的同時(shí)，各種有害因素對(duì)神經(jīng)元的直接破壞作用也不可忽視。有關(guān)MS的研究中在圍繞如何減輕炎性反應(yīng)、保護(hù)髓鞘的同時(shí)，也應(yīng)該重視對(duì)軸索的保護(hù)。

雷公藤多甙具有抗炎、抗免疫、抗腫瘤等多種活性，已在臨床廣泛運(yùn)用［18］。鄭和忠等的實(shí)驗(yàn)表明雷公藤多甙能明顯減輕EAE大鼠發(fā)病病情和延緩發(fā)病時(shí)間［19］。近年來又有研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙還具有神經(jīng)保護(hù)功能［20］。本研究給予TWP干預(yù)治療后在EAE模型大鼠發(fā)病高峰期可觀察到TWP能減輕EAE大鼠臨床癥狀，減少EAE發(fā)病。TWP組炎性細(xì)胞浸潤及血管“袖套”明顯減少，病理評(píng)分為（1.05±0.36）分。TWP組病理評(píng)分較EAE組降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化法檢測(cè)與EAE比較，TWP組大鼠組織中β－APP陽性表達(dá)水平降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL－17水平也較EAE組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)表明TWP干預(yù)使大鼠EAE的發(fā)生明顯受到抑制，EAE嚴(yán)重程度評(píng)分和病理改變都明顯減輕。因此，認(rèn)為TWP對(duì)EAE大鼠有保護(hù)作用，且這種作用可能與TWP降低β－APP、IL－17表達(dá)，減輕軸索損傷和炎性細(xì)胞活性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)提示TWP可干預(yù)EAE中β－APP、IL－17的表達(dá)，從而可能對(duì)EAE起到一定的治療作用，這為我們探討MS發(fā)病及治療提供了新的前景。

1 Gold R，Luhder F.Interleukin－17 extended features of a key player in multiple sclerosis.Am J Pathol，2008，172（1）：8－10.

2 Medana IM，Esiri MM.Axonal damage：a key predictor of outcome inhuman CNS diseases.Brian，2003，126（Pt3）：515－513.

3 Mancardi G，Hart B，Roccatagliata L，et al.Demyelination and axonal damage in a non－h(huán)uman primate model of multiple sclerosis.J Neurol Sci，2001，184（1）：41－49.

4 董 梅，劉瑞春，郭 力，等.多病程Wistar大鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的病理研究.腦與神經(jīng)疾病雜志，2004，12（6）：416－419.

5 Hooper DC，Spitsin S，Kean RB，et al.Uric acid，a natural scavenger of peroxynitrite，in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（2）：675－680.

6 Matusevicius D，Kivisakk P，He B，et al.Interleukin－17 mRNA expression in blood and CSF mononuclear cells is augmented in multiple sclerosis.Mult Scler，1999，5（2）：101－104.

7 梁軍利，趙麗君，呂海東，等.甲基強(qiáng)的松龍對(duì)復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化血清及腦脊液白介素－23、白介素－17水平的影響.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2014，13（3）：301－303.

8 Kebir H，Kreymborg K，Ifergan I，et a1.Human TH17 lymphocytes promote blood－brain barrier disruption and central nervous system inflammation.Nat Med，2007，13（10）：1173－1175.

9 Komiyama Y，Nakae S，Matsuki T，et al.IL－17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis.J Immunol，2006，177（1）：566－573.

10 Greter M，Heppner FL，Lemos MP，et al.Dendritic cells permit immune invasion of the CNS in an animal model of multiple sclerosis.Nat Med，2005，11（3）：328－334.

11 Bitsch A，Schuchardt J，Bunkowski S，et al.Acute axonal injury in multiple sclerosis.Brain，2000，123（pt6）：1174－1183.

12 Bjartmar C，Kidd G，Mork S，et al.Neurological disability correlates with spinal cord axonal loss and reduced N－acetyl aspartate in chronic multiple sclerosis patients.Ann Neurol，2000，48（6）：893－901.

13 Amold DL.Changes observed in multiple sclerosis using magnetic resonance imaging reflect a focal pathology distributed along axonal pathways.J Neurol，2005，252（Suppl 5）：v25－29.

14 Coleman M.Axon degeneration mechanisms：commonality amid diversity.Nat Rev Neurosci，2005，6（11）：889－898.

15周建波，曾 麗，曾廣凌，等.米諾環(huán)素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠軸索損傷的影響.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（6）：957－959.

16 Ghosh N，Deluca G C，Esiri M M.Evidence of axonal damage in human acute demyelinating diseases.J Neurol Sci，2004，222（1－2）：29－34.

17 Neumann H，Medana IM，Bauer J，et al.Cytotoxic T lymphocytes in autoimmune and degenerative CNS diseases.Trends Neurosci 2002，25（6）：313－319

18 Ma WG，Zhang T，Zhang C，et al.Study and prospect on venomous Tripterygium wilfordii Hook.f.China J Tradit ChinMed Pharm，2006，21（2）：117－120.

19鄭和忠，余昌胤.雷公藤內(nèi)脂醇對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦和脊髓ICAM－1表達(dá)的影響.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2007，14（3）：154－156.

20張 艷，賈丹輝，劉宗文，等.雷公藤多甙對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.中國新藥與臨床雜志，2005，24（11）：862－864.