栗建新

茶多酚(tea polyphenols，TP)是從天然植物茶葉中分離提純的30多種酚類化合物的復(fù)合體，約占茶葉干物質(zhì)總量的20%～30%，包括兒茶素、黃烷雙醇、類黃酮和酚酸四類物質(zhì)。其中兒茶素是茶葉多酚類物質(zhì)的主要成分，約占多酚類物質(zhì)的80%，屬黃烷醇類。茶多酚具有抗腫瘤、降血脂、降血壓、降糖、抑菌、抗病毒等多種藥理作用[1-4]。本研究采用體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，酸環(huán)境介導(dǎo)損傷模型，觀察茶多酚對體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品與材料 茶多酚(TP≥98%) (杭州怡倍嘉茶葉科技有限公司)；鹽酸阿糖胞苷(上海華聯(lián)制藥有限公司，DMEM/F-12 HYCLONE公司)；胰蛋白酶干粉(美國Gibco公司)；胎牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)；0.1%多聚左旋賴氨酸(美國sigma公司)；過氧化氫(H2O2)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級新生24 h內(nèi)SD大鼠，河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3儀器設(shè)備 水套式二氧化碳孵箱(德國GmbH公司);722紫外分光光度(上海第三分析儀器);高速低溫離心機(jī)(德國BECMAN產(chǎn)品)。

1.4大鼠皮層神經(jīng)元的體外培養(yǎng) 取出生后24 h內(nèi)的SD乳鼠，用無齒鑷取兩側(cè)大腦皮層，放入盛有D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中，輕輕剔除未去盡的腦膜后，用眼科剪倒碎腦組織1 mm3。然后加入 0.25%胰酶 37℃， 消化15 min，終止消化，離心去上清，加入適當(dāng)?shù)?0%胎牛血清的DMEM/F12，用光滑的細(xì)口吸管輕輕吹打數(shù)次，用 200目的尼龍網(wǎng)過濾，以 1×106個(gè)/ml 的密度將細(xì)胞種植在預(yù)先放有包被多聚 L賴氨酸培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第2天加入10 μmol/L阿糖胞苷作用24 h后全部換液，以后每2天換液1次，每次換半量。培養(yǎng)6 d后NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色確定為神經(jīng)元。

1.5酸性環(huán)境介導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元損傷模型建立及給藥方式 取培養(yǎng)6 d的大鼠皮層神經(jīng)元隨機(jī)分為以下幾組：①正常組；②酸環(huán)境損傷組；③TP高、中、低濃度組(80 mg/L、40 mg/L、20 mg/L)。正常對照組常規(guī)換液一次，其余各組細(xì)胞除去原培養(yǎng)液，用D-Hank’s液洗滌2遍，酸環(huán)境損傷組加入pH 6.0的低糖DMEM液，各給藥組在酸環(huán)境損傷處理過程中分別加入含不同濃度TP低糖DMEM液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)1 h后，進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.6生化指標(biāo)測定 按照試劑盒說明，比色法測定上層培養(yǎng)液中過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA) 和乳酸脫氫酶(LDH)的含量。

2 結(jié)果

TP對大鼠皮層神經(jīng)元經(jīng)酸環(huán)境損傷后細(xì)胞培養(yǎng)液中H2O2、LDH和MDA的影響,研究結(jié)果顯示，模型組與正常組比較，大鼠皮層神經(jīng)元在培養(yǎng)液中的 H2O2、LDH和MDA釋放明顯增多(P< 0.01)；TP高、 中、 低各個(gè)劑量組對酸環(huán)境引起損傷的大鼠皮層神經(jīng)元在培養(yǎng)液中H2O2、LDH和MDA釋放量具有不同程度的降低作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，見表1。

表1 TP對體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元損傷時(shí)培養(yǎng)基中H2O2、LDH和MDA的影響

注：a，P<0.01 VS 正常組；b，P<0.01 VS 模型組

3 討論

在腦缺血期時(shí)，由于氧供不足致使腦組織進(jìn)行無氧的糖酵解，產(chǎn)物乳酸和ATP水解產(chǎn)物質(zhì)子的積聚致缺血性組織周圍的pH值顯著下降，導(dǎo)致缺血區(qū)組織周圍的pH值明顯地從7.3降到6.0[5]，致使神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元調(diào)往或死亡。H2O2作為體內(nèi)的一種自由基，它的含量的高低也會(huì)直接反映體內(nèi)過氧化水平的高低；LDH是無氧酵解中的一個(gè)關(guān)鍵酶，廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，正常情況下很少從胞漿中釋放，病理情況時(shí)細(xì)胞膜通透性增高，LDH漏出增加，是細(xì)胞受損的一個(gè)敏感指標(biāo)。因此，檢測LDH的漏出量可反映細(xì)胞損傷的程度；自由基增加，氧自由基可使細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起對細(xì)胞的損害，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，由于MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且其含量能夠體現(xiàn)組織細(xì)胞中氧自由基的含量。從本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，酸性環(huán)境損傷1 h可使神經(jīng)元培養(yǎng)液中H2O2、LDH和MDA含量顯著增高，而TP可呈濃度依賴性的減少損傷所引起的H2O2、LDH和MDA含量，提示TP具有較強(qiáng)的抗氧化能力。以上指標(biāo)從不同的方面證明了TP對皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用。

綜上所述，TP對酸介導(dǎo)神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與清除自由基和抗氧化性有關(guān)。TP對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的其它機(jī)制，這尚需進(jìn)一步研究。

[1] 宿迷菊,王岳飛,駱耀平，等.茶多酚抗炎作用研究進(jìn)展.茶葉,2006,32(1):10-13.

[2] 林親錄，施兆朋，劉湘新，等.兒茶素和表兒茶素對動(dòng)物血脂的影響.中國食品學(xué)報(bào)，2002，2(3):16-20.

[3] 胡秀芳,楊賢強(qiáng)，陳留記.茶多酚對皮膚的保護(hù)與治療作用.福建茶葉,2000,12 (2): 44-45.

[4] 胡秀芳,楊賢強(qiáng).茶兒茶素對癌細(xì)胞凋亡作用的研究.茶葉科學(xué),2001,21(1):26-29.

[5] Hoffman WE, Charbel FT, Edelman G,et al. Brain tissue acid-base change during ischemia. Neurosurg Focus,1997,2(5):E2.