安曉東，楊國龍，楊力會，畢艷蘭，彭 丹

（河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

有機溶劑中的酶催化反應已成為近二十年來的研究熱點，但由于天然酶分子在有機溶劑中應用時多存在熱穩(wěn)定性差、易失活、不易回收利用等問題，所以研究者多采用不同的方法對酶分子進行修飾.根據(jù)酶與修飾分子作用力的不同，可將酶的修飾方法分為：共價修飾和非共價修飾，表面活性劑修飾脂肪酶屬于非共價修飾[1].表面活性劑對酶的修飾，主要是通過它的兩親性質實現(xiàn)的；表面活性劑的親水基團與酶分子的羥基形成氫鍵結合在一起，親油部分則伸向有機溶劑，這就避免了酶分子與有機溶劑的直接接觸而可能引起的酶變性失活.自從Okahata 等[2]首先報道了表面活性劑包衣酶（即修飾酶）的概念后，因該方法具有制備容易，穩(wěn)定性高，酶活損失小，酶表面含水量低，有機溶劑選擇范圍廣等優(yōu)點，受到了人們廣泛的關注和研究.多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)修飾過的脂肪酶催化活性高，選擇性高，反應條件溫和，有利于在有機溶劑的反應，并且方便分離和重復使用，也可以提高酶的利用率[3-5].

在利用專一性酶催化油脂酯交換反應的過程中，往往都會伴隨著?；灰频陌l(fā)生，?；灰频陌l(fā)生直接影響著酯交換的反應產(chǎn)物組成.科研工作者很早就已經(jīng)注意到?；灰品矫娴膯栴}.影響酰基位移的因素很多，如反應時間、反應溫度、加酶量、加水量、底物比、?；湹拈L度等，其中，反應溫度對?；灰朴兄苯佑绊慬6-7].一般認為，?；灰频臋C理是由于甘二酯或甘一酯的羥基氧原子的孤對電子對羰基碳的親核進攻引發(fā)的，從而形成了一個五元環(huán)中間體，五元環(huán)隨后從碳氧鍵裂開，形成了更穩(wěn)定的甘二酯或甘一酯[8].

本研究采用非離子表面活性劑修飾的脂肪酶作為催化劑，以茶油和亞油酸為原料進行酯交換反應，分析反應過程中酯交換量、?；灰坪头磻w系中各組分含量，考察非離子表面活性劑的修飾作用對酶催化酯交換反應的影響，為酯交換過程中的?；灰蒲芯刻峁┮恍├碚摶A.

1 材料與方法

1.1 材料

豬胰脂酶：實驗室自制；茶油：河南信陽長園野生茶油有限公司（酸價0.68 mg/g；過氧化值3.98 mmol/kg；脂肪酸組成見表1）；亞油酸（≥96%）：實驗室自制（脂肪酸組成見表2）；吐溫（Tween40、Tween65）、司盤（Span60、Span80）、蔗糖酯（S1170、S1670）及甘一酯標品、甘二酯標品、甘三酯標品：Sigma 公司.

正己烷、異丙醇、冰乙酸均為色譜純；無水乙醇、無水乙醚、石油醚（30～60 ℃）、甲酸、異辛烷、無水硫酸鈉和硅膠G 均為分析純；以上試劑均為天津市科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn).

1.2 儀器與設備

6890N 氣相色譜儀：美國Agilent 公司；色譜柱BPX-70（30 m×250 μm×0.25 μm）：澳大利亞SGE公司；Waters2695 高效液相色譜儀及Waters2420 蒸發(fā)光檢測器：美國Waters 公司；Yp5002 電子天平：北京科實興業(yè)科技有限公司；ZF-I 型三用紫外分析儀：上?？等A生化儀器制造有限公司.

1.3 方法

1.3.1 原料理化性質分析

油脂酸價測定參照GB/T 5530—2005 動植物油脂酸值和酸度測定.

過氧化值的測定參照GB/T 5538—2005 動植物油脂過氧化值測定.

1.3.2 脂肪酶的修飾

各非離子表面活性劑的修飾方法均按其最佳修飾方法修飾，具體修飾方法參照課題組前期研究[9-11].

1.3.3 酶催化酯交換反應

將稱量好的茶油、亞油酸加入250 mL 圓底燒瓶中，在60 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)攪拌.再加入100 mL異辛烷（經(jīng)分子篩處理）和0.4%（V/V）的蒸餾水，攪拌一定時間后，加入脂肪酶開始反應.反應過程中間隔取點處理，采用氣相色譜分析產(chǎn)物中甘三酯全樣及sn-2 位脂肪酸組成；采用液相色譜分析產(chǎn)物中甘一酯（MG）、甘二酯（DG）、甘三酯（TG）及脂肪酸（FA）的含量.

酯交換量（%）=L后-L前，

式中：L前為反應前甘三酯中亞油酸的質量百分含量，即茶油中亞油酸的質量百分含量；L后為反應后甘三酯中亞油酸的質量百分含量，即產(chǎn)物甘三酯中亞油酸的質量百分含量.

?；灰疲?）=（O前-O后）/O前×100，

式中：O前為反應前甘三酯sn-2 位脂肪酸組成中油酸的質量百分含量，即茶油sn-2 位脂肪酸組成中油酸的質量百分含量；O后為反應后甘三酯sn-2 位脂肪酸組成中油酸的質量百分含量，即產(chǎn)物甘三酯sn-2 位脂肪酸組成中油酸的質量百分含量.

1.3.4 甘三酯脂肪酸組成及其sn-2 位脂肪酸組成分析

甘三酯脂肪酸組成、sn-2 位脂肪酸組成分析參照孫江彥等[11]的前期研究.氣相色譜儀：Agilent 6890N；檢測器：氫火焰離化檢測器；毛細管脂肪酸分析色譜柱：BPX-70；進樣口溫度：230 ℃；柱溫：180 ℃；檢測器溫度：300 ℃；氮氣流速：1.5 mL/min.

1.3.5 產(chǎn)物組成成分分析

采用液相色譜分析產(chǎn)物中甘一酯（MG）、甘二酯（DG）、甘三酯（TG）及脂肪酸（FA）的含量.條件如下：色譜柱，Sunfire Prep Silica 5 m 4.6×250 mm；流動相，V正己烷∶V異丙醇∶V乙酸=84∶15∶1，流速1 mL/min，梯度洗脫條件參照Marcato 等[12]的研究.ELSD 檢測條件：氮氣壓力，35 psi；漂移管溫度，60 ℃.

2 結果與分析

2.1 非離子表面活性劑的修飾作用對酶促酯交換過程中酯交換量的影響（圖1）

由圖1 可知，在12 h 后所有的酶催化反應基本趨于平衡，酯交換量均達到25%以上且變化不大；反應平衡時，各反應的酯交換量相差不大，都為30%左右.但在反應達到平衡前，不同酶催化酯交換反應時，酯交換量的增加速率即反應速率均不相同.其中，PPLipase 催化反應的反應速率最慢，反應24 h 左右才趨于平衡，平衡時酯交換量為28.3%.Span80-PPLipase、S1170-PPLipase 和S1670-PPLipase 催化酯交換反應的效率明顯高于其他酶的催化效率；Span80-PPLipase 催化反應的反應速率最快，反應在2 h 酯交換量已達到25%左右，在12 h 時酯交換量已達到最大值29.9%.Span60-PPLipase、Tween40-PPLipase 和Tween65-PPLipase的催化效果基本相同，但都優(yōu)于PPLipase.可見用非離子表面活性劑修飾的脂肪酶，其催化活性都得到了提高.

表1 茶油脂肪酸組成 %

表2 亞油酸脂肪酸組成 %

圖1 酯交換過程中酯交換量隨時間的變化

2.2 非離子表面活性劑的修飾作用對酶促酯交換過程中酰基位移的影響（圖2）

由圖2 A 可以看出，在反應過程中，各種酶所催化反應的?；灰频淖兓厔莼鞠嗤?在酯交換量為20%以前，各反應?；灰瞥潭榷驾^低且增加十分緩慢，之后酰基位移均快速增加.當酯交換量在20%以下時，Span80-PPLipase、S1170-PPLipase 和S1670-PPLipase 所催化反應的?；灰苹鞠嗤?，都在5%以下，且Span80 修飾酶催化的反應?；灰谱钚。ㄐ∮?%）；Tween65-PPLipase、Tween40-PPLipase 和Span60-PPLipase 催化反應的?；灰贫荚?0%以下；豬胰脂酶催化反應的?；灰谱畲?，酯交換量為20%時，?；灰埔堰_到16%左右.當酯交換量大于25%時，PPLipase 和修飾PPLipase 催化反應的酰基位移迅速增加，這說明酯交換反應接近平衡以后，反應的酰基位移明顯增加.

由圖2 B 可知，各種酶所催化反應的?；灰婆c時間的關系基本相同.都是隨著時間的增加，?；灰埔搽S之增加.當反應24 h 后，各反應的?；灰坡驶颈３植蛔?反應平衡后，豬胰脂酶催化的反應?；灰坡首畹停s為28%，S1670-PPLipase 催化的反應酰基位移率最高，約為41%.S1170-PPLipase、Tween40-PPLipase、Tween65-PPLipase、Span80-PPLipase 和Span60-PPLipase 催化反應的酰基位移率在28%～41%之間.

圖2 反應過程中?；灰齐S酯交換量（A）和時間（B）的變化

2.3 非離子表面活性劑的修飾作用對酶促酯交換過程中各組分含量的影響

如前所述，在12 h 后所有的酶催化反應基本趨于平衡，酯交換量均達到25%以上（圖1）.當反應達到平衡以后，各組分的含量雖然有小幅波動，但都是基本趨于穩(wěn)定的（圖3）.在PPLipase 和修飾PPLipase 催化酯交換過程中，隨著反應時間的延長酯交換量不斷增加，體系內(nèi)甘三酯含量不斷減少，基本都在酯交換量大于25%后趨于不變（圖3 A）；脂肪酸的含量不斷增加，當反應趨于平衡時，脂肪酸含量趨于不變（圖3D）；甘二酯在反應開始的最初階段，含量迅速增加，稍后甘二酯含量基本維持在8%左右（圖3B）.

在反應的開始階段體系中未檢測到甘一酯的存在；PPLipase 催化的反應在酯交換量為17%時檢測到甘一酯的存在（12.5%），隨著酯交換反應的進行甘一酯含量變化不明顯（13%左右）；Tween40-PPlipase 催化的反應在酯交換量達13%時有少量甘一酯（約為4%）生成，隨后甘一酯含量有所增加，反應達平衡時甘一酯含量約為13%；Tween65-PPLipase 催化的反應在酯交換量達到21%時檢測到甘一脂的生成（約7%），隨著反應進行含量有所增加，最終在12%～17%間波動.Span60-PPlipase催化的反應在酯交換量達到24%時，檢測到甘一酯的存在（約10%），隨酯交換反應的進行甘一酯含量在10%左右波動.Span80-PPLipase、S1170-PPLipase 和S1670-PPLipase 催化的反應，在酯交換量小于20%前，未檢測到甘一酯的存在，隨酯交換反應的進行甘一酯含量在10%～16%間波動.

圖3 酯交換過程中各組分含量隨酯交換量的變化

造成上述現(xiàn)象的原因主要是，脂肪酶在催化酯交換反應時，實際上是分兩步進行反應的：水解和酯化，即甘三酯先進行水解生成甘二酯和甘一酯，再催化甘二酯和甘一酯與脂肪酸進行酯化反應[13].因為在反應初期沒有檢測到甘一酯生成，且本試驗所用的脂肪酶為sn-1，3 位專一性脂肪酶，在反應剛開始階段，專一性脂肪酶先催化甘三酯迅速水解，且只水解掉了sn-1（3）位的一個?；鶊F生成甘二酯，隨后才進行酯化反應.在不同修飾酶催化的反應中，當酯交換量在5%以下時，甘二酯的含量已經(jīng)在8.0%左右不再變化，可能是因為在酶催化酯化反應時，需要一定量的甘二酯來維持底物濃度，以便充分發(fā)揮酶的活性，使甘二酯與脂肪酸的酯化速率達到試驗條件下的最大值.Sobhi Basheer 等[14]用脂肪酶催化三棕櫚酸甘三酯與硬脂酸進行酯交換反應，發(fā)現(xiàn)在反應初期，約有6%的甘二酯會迅速生成并且不再變化.

除PPLipase 催化的反應外，其他酶催化的反應在酯交換量小于20%時，酰基位移率都在5%以下（圖2）；此時體系內(nèi)甘二酯含量已經(jīng)達到最大值，甘一酯的含量幾乎為0（圖3B 和圖3C）.由此，可以認為在反應開始階段，體系內(nèi)酯交換速率較快，甘三酯水解所生成的甘二酯來不及被脂肪酶進一步水解為甘一酯，就已經(jīng)開始進行酯化或者酯交換反應了，導致體系內(nèi)沒有甘一酯生成.此時，甘二酯含量雖然已達到最大值，但酰基位移率僅在5%以下，這說明在試驗條件下，僅有很少量的甘二酯發(fā)生了?；灰?Kodali 等[15]在研究sn-1，2 甘二酯向sn-1，3 甘二酯轉變的過程中發(fā)現(xiàn)，當反應達到平衡時，體系內(nèi)sn-1，3 甘二酯含量達到56%.

3 結論

非離子表面活性劑的修飾作用在一定程度上提高了豬胰脂酶的催化活性.在酯交換量達到20%以前，非離子表面活性劑的修飾作用均可以使豬胰脂酶催化酯交換?；灰坡视兴档?當反應趨于平衡時，豬胰脂酶催化的反應?；灰坡首畹?，約為28%，S1670-PPLipase 催化反應的?；灰坡首罡撸s為41%，S1170-PPLipase、Tween40-PPLipase、Tween65-PPLipase、Span80-PPLipase、Span60-PPLipase 催化反應的?；灰坡试?8%～41%之間，且依次降低.

在豬胰脂酶催化酯交換過程中，當酯交換量低于20%時，各反應體系內(nèi)的?；灰坡识嫉陀?%.甘二酯含量在反應開始初期就已達到最大值，且不再隨反應變化.當酯交換量高于20%時，酰基位移率和甘一酯含量迅速增加，此時體系內(nèi)酶催化的水解速率要大于酯化速率.隨著反應趨于平衡，體系內(nèi)各組分含量及?；灰坡示呌诓蛔?

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