張 飛，趙靜國(guó)，趙蒙浩

(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)是動(dòng)物體膽汁中的一種生化物質(zhì)，臨床上不僅用作溶解膽固醇類(lèi)結(jié)石和糾正飽和膽汁的藥物，還具有顯著的平喘、抗炎、鎮(zhèn)咳和祛痰作用，同時(shí)鵝去氧膽酸還是昂貴的熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)的合成原料[1]。熊去氧膽酸是名貴中藥熊膽中的主要有效成分，在臨床上用于治療各種膽石疾病及急慢性肝病，具有良好的效果[2]。

目前，制備鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸主要有動(dòng)物膽汁提取和人工合成兩種方法，但動(dòng)物膽汁提取來(lái)源有限，難以滿足醫(yī)療需要?，F(xiàn)有合成鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸的路線多以牛羊膽酸為起始原料，但該原料價(jià)格昂貴。作者參照文獻(xiàn)[3-4]以廉價(jià)易得的豬去氧膽酸(hyodesoxycholic acid,HDCA)為原料合成鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸，優(yōu)化了合成工藝條件。其合成路線如圖1所示。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

豬去氧膽酸(純度≥98%)，自制，經(jīng)熔點(diǎn)、1HNMR和MS確認(rèn)；乙腈(色譜純)；重蒸餾水；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

YRT-3型熔點(diǎn)儀，天津大學(xué)精密儀器廠；Mercury Plus-400型核磁共振氫譜儀，美國(guó)Varian公司；Trace MS2000型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Finnigan公司；戴安P680型高效液相色譜儀；戴安UVD170U型檢測(cè)器；Grace Davison Discovery Sciences C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)。

1.2 方法

1.2.1 3α,6α-二對(duì)甲苯磺酰氧基-5β-膽烷酸甲酯(Ⅱ)的制備

取20 g豬去氧膽酸(Ⅰ)溶于120 mL甲醇中，加入12 mL濃鹽酸，攪拌回流3 h，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢；自然冷卻，加入Na2CO3中和至中性，減壓濃縮除去大部分甲醇，殘留物用乙酸乙酯提取，濾除無(wú)機(jī)鹽，濾液用飽和NaHCO3洗滌1次、水洗2次，用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得白色固體即豬去氧膽酸甲酯20 g，粗產(chǎn)率為98%。

取16 g豬去氧膽酸甲酯溶于48 mL吡啶中，冰水浴攪拌溶解，然后分批加入20 g對(duì)甲苯磺酰氯(經(jīng)石油醚重結(jié)晶)，冰水浴反應(yīng)2 h，室溫?cái)嚢?4 h，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢;將反應(yīng)液倒入加有碎冰的5%鹽酸溶液中，待固體析出后，抽濾，水洗，干燥，得白色固體粉末，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，干燥，得白色固體即化合物Ⅱ26 g，產(chǎn)率為93%。

1.2.2 Δ5-3β-羥基膽烷酸甲酯(Ⅲ)的制備

將28.8 g醋酸鉀、160 mL DMF和24 mL水混合，升溫至110 ℃后，保溫15 min，加入24 g化合物Ⅱ，回流攪拌4 h，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢；冷卻至室溫，有白色固體析出，倒入1 200 mL加有碎冰的5%鹽酸溶液中，劇烈攪拌，過(guò)濾，水洗濾液至中性，干燥，得白色固體。向該白色固體中加入210 mL 2%的KOH甲醇溶液，室溫?cái)嚢? h，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢；用5%的鹽酸中和至中性，減壓濃縮除去大部分甲醇，加入冰水，待固體析出后，抽濾，水洗，重結(jié)晶(乙酸乙酯-石油醚)，干燥，得白色固體即化合物Ⅲ10.8 g，產(chǎn)率為83%。

a.37.5%HCl,MeOH b.p-TsCl,Py c.KAc,DMF,H2O d.異丙醇鋁，環(huán)己酮 e.四氯苯醌，EtOAc f.m-CPBA，CH2Cl2g.10%Pd/C,EtOH h.KBH4,MeOH i.NaOH,MeOH j.NBS,Acetone-H2O k.KBH4,CeCl3·7H2O,THF-MeOH圖1 鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸的合成路線Fig.1 The synthetic routes of CDCA and UDCA

1.2.3 Δ4-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅳ) 的制備

取10 g化合物Ⅲ溶于200 mL甲苯中，升溫至110 ℃，采用分水裝置蒸出約40 mL甲苯后，加50 mL環(huán)己酮，繼續(xù)蒸餾出約30 mL甲苯，加入3 g異丙醇鋁回流攪拌反應(yīng)3 h，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢；冷卻至室溫，加入10%的硫酸溶液洗滌2次，分去水層，有機(jī)相用飽和NaCl溶液洗至中性，蒸干甲苯，用乙酸乙酯提取，水洗，用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，得到的固體再用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，干燥，得到白色固體即化合物Ⅳ8.5 g，產(chǎn)率為85%。

1.2.4 Δ4，6-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅴ) 的制備

取8 g化合物Ⅳ溶于250 mL乙酸乙酯中，加入8 g四氯苯醌和1 mL對(duì)甲苯磺酸，回流攪拌反應(yīng)3 h，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢；自然冷卻，過(guò)濾，濾渣用乙酸乙酯洗滌，合并有機(jī)相，依次用5%NaOH溶液、飽和NaHSO3溶液、飽和NaCl溶液洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，柱層析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶9)，得淡黃色固體即化合物Ⅴ6.5 g，產(chǎn)率為82%。

1.2.5 6α，7α-環(huán)氧-Δ4-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅵ)的制備

取7.5 g間氯過(guò)氧苯甲酸加入到80 mL二氯甲烷中，冰水浴攪拌，滴加含6 g化合物Ⅴ的120 mL二氯甲烷溶液，保溫反應(yīng)72 h，過(guò)濾，濾渣用二氯甲烷充分洗滌，合并有機(jī)相，用飽和NaHCO3溶液洗滌，然后水洗至中性，干燥，減壓濃縮，柱層析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶5)，得化合物Ⅵ4.7 g，產(chǎn)率為75%。

1.2.6 5β，7α-羥基-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅶ)的制備

取4 g化合物Ⅵ溶于100 mL無(wú)水乙醇中，加入3 g 10%Pd/C，在少量吡啶催化作用下攪拌吸氫反應(yīng)24 h，過(guò)濾，濾渣用二氯甲烷充分洗滌，合并有機(jī)相，水洗至中性，用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，柱層析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶4)，得化合物Ⅶ3.1 g，產(chǎn)率為78%。

1.2.7 鵝去氧膽酸(Ⅷ)的制備

取2 g化合物Ⅶ溶于50 mL甲醇中,加入1 g KBH4,室溫?cái)嚢? h,加入醋酸終止反應(yīng)；蒸干溶劑，用乙酸乙酯提取,有機(jī)相用飽和NaHCO3溶液洗滌,然后水洗至中性,用無(wú)水硫酸鈉干燥,減壓濃縮，柱層析(V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶1)，得淡黃色固體1.7 g；分別加入20 mL乙醇、0.5 g氫氧化鈉和4 mL水，攪拌回流反應(yīng)5 h,減壓回收溶劑至干，將得到的固體加水溶解，攪拌下用5%鹽酸溶液酸化，待固體析出后，抽濾，濾餅水洗至中性，干燥，用乙酸乙酯重結(jié)晶，得淡黃色固體即鵝去氧膽酸1.6 g，兩步產(chǎn)率82%，總產(chǎn)率為26%，純度經(jīng)HPLC檢測(cè)為97.5%。

1.2.8 5β，3α-羥基-7-酮膽烷酸(Ⅸ)的制備

取1 g鵝去氧膽酸溶于48 mL丙酮-水(3∶1，體積比)中,再加0.65 g NBS，室溫下攪拌反應(yīng)2 h，經(jīng)TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢；加入20%NaHSO3，蒸干丙酮，然后用5%的鹽酸溶液酸化，待固體析出后過(guò)濾，濾渣水洗至中性，干燥，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶后再干燥，得白色固體即化合物Ⅸ0.87 g，產(chǎn)率為87%。

1.2.9 熊去氧膽酸(Ⅹ)的制備

取0.8 g化合物Ⅸ和0.6 g CeCl3·7H2O溶于36 mL THF-MeOH(2∶1，體積比)中，室溫?cái)嚢柘录尤?.4 g KBH4并反應(yīng)3 h，蒸干溶劑，得淡黃色固體；用Na2CO3溶液溶解，過(guò)濾，濾液加5%鹽酸溶液酸化，待固體析出后過(guò)濾，水洗，干燥，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶后再干燥，得白色固體即熊去氧膽酸0.68 g，產(chǎn)率85%，總產(chǎn)率為19%，純度經(jīng)HPLC檢測(cè)為96.2%。

2 結(jié)果與討論

2.1 中間產(chǎn)物及目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

化合物Ⅱ:m.p.168～170 ℃(文獻(xiàn)[5]值166～167 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3)，δ：7.71(d,2H,o-H×2)，7.36(d,2H,o-H×2)，7.34(d,2H,m-H×2)，7.32(d,2H,m-H×2)，4.78(t,1H,6β-H)，4.31(m,1H,3β-H)，3.68(s,3H,24-OCH3)，2.50(s,3H,p-CH3)，2.46(s,3H，p-CH3)，0.88(d,3H,21-CH3)，0.80(s,3H,19-CH3)，0.59(s,3H，18-CH3)。

化合物Ⅲ:m.p.142～144 ℃(文獻(xiàn)[5]值143～144 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:5.35(d,1H,6-H),3.68(3H,s,24-OCH3),3.52(m,1H,3H),0.98(s,3H,19-CH3),0.91(d,3H,21-CH3),0.67(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅳ:m.p.122～124 ℃(文獻(xiàn)[3]值122～124 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:5.72(s,1H,4-H),3.67(s,3H,24-OCH3),1.13(s,3H,19-CH3),0.93(d,3H,21-CH3),0.70(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅴ:m.p.153～154 ℃(文獻(xiàn)[3]值151～153 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:6.13(d,1H,6-H),6.10(d,1H,7-H),5.67(s,1H,4-H),3.68(s,3H,24-OCH3),1.10(s,3H,19-CH3),0.93(d,3H,21-CH3),0.76(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅵ:m.p.148～150 ℃(文獻(xiàn)[3]值149～151 ℃)。1HNMR(400 MHz，CDCl3),δ:6.10(s,1H,6-H),3.68(s,3H,24-OCH3),3.45(d,1H,7-H),3.34(d,1H,6-H),1.20(s,3H,19-CH3),0.93(d,3H,21-CH3),0.74(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅶ:m.p.127～128 ℃(文獻(xiàn)[3]值128～129 ℃)。1HNMR( 400 MHz，CDCl3)，δ:3.84(s,1H,7-H)，3.68(s,3H,24-OCH3)，1.20(s,3H,19-CH3)，0.93(d,3H,21-CH3)，0.66(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅷ:m.p.142～143 ℃(文獻(xiàn)[6]值144～146 ℃)。MS(m/z):392.6。1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:11.91(s,1H,24-COOH)，4.31(d,1H,3α-OH)，4.11(d,1H,7α-OH)，3.62(m,1H,7-CH)，3.18(m,1H,3-CH)，0.97(d,3H,21-CH3)，0.87(s,3H,19-CH3)，0.62(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅸ:m.p.204～206 ℃(文獻(xiàn)[7]值206～210 ℃)。1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:11.96(s,1H,24-COOH)，4.48(d,1H,3α-OH)，2.90(q,1H,8-CH)，2.44(t,1H,6-CH)，1.10(d,3H,21-CH3)，0.92(s,3H,19-CH3)，0.65(s,3H,18-CH3)。

化合物Ⅹ:m.p.201～202 ℃(文獻(xiàn)[8]值197～202 ℃)。MS(m/z):392.6。1HNMR( 400 MHz，DMSO-d6),δ:11.94(s,1H,24-COOH),4.44(d,1H,3α-OH),3.87(d,1H,7β-OH),0.99(d,3H,21-CH3),0.88(s,3H,19-CH3),0.61(s,3H,18-CH3)。

2.2 合成工藝的優(yōu)化

1)制備化合物Δ5-3β-羥基膽烷酸甲酯(Ⅲ)時(shí)，參照文獻(xiàn)[5]的條件，反應(yīng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生一極性比產(chǎn)品較小的雜質(zhì)，經(jīng)熔點(diǎn)和核磁共振確認(rèn)該雜質(zhì)為Δ5-3β-乙?；?膽烷酸甲酯，為使其轉(zhuǎn)化為化合物Ⅲ，設(shè)計(jì)了不同KOH含量的甲醇溶液與不同水解時(shí)間的正交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2%KOH 的甲醇溶液室溫水解2 h時(shí)的效果最好，Δ5-3β-羥基膽烷酸甲酯(Ⅲ)的產(chǎn)率明顯提高。

2)制備化合物Δ4-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅳ)時(shí)，文獻(xiàn)[3]采用柱層析，本研究嘗試用無(wú)水乙醇重結(jié)晶純化，得到了化合物Ⅳ純品。

3)制備化合物Δ4，6-3-酮膽烷酸甲酯(Ⅴ)時(shí)，先參照文獻(xiàn)[3]使用醋酸作催化劑，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中雜質(zhì)較多，然后參照文獻(xiàn)[9]，嘗試以無(wú)水AlCl3、草酸、對(duì)甲苯磺酸作為催化劑，發(fā)現(xiàn)對(duì)甲苯磺酸作催化劑時(shí)產(chǎn)物雜質(zhì)少，且產(chǎn)率有所提高。

4)制備熊去氧膽酸(Ⅹ)過(guò)程中，對(duì)鵝去氧膽酸進(jìn)行選擇性還原7位酮基時(shí)文獻(xiàn)[8]采用了劇烈的、不易控制的堿金屬鈉作為還原劑，不宜進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本研究改用溫和的還原劑硼氫化鉀在CeCl3催化作用下對(duì)7位酮基進(jìn)行立體選擇性β-還原得到熊去氧膽酸。改進(jìn)后的工藝條件溫和、操作簡(jiǎn)單，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。

3 結(jié)論

以資源豐富的豬去氧膽酸為原料，經(jīng)甲酯化后與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)生成3α，6α-二對(duì)甲苯磺酰氧基-5β-膽烷酸甲酯，經(jīng)消去、Oppenauer氧化、 6、 7位脫氫、環(huán)氧化、催化氫化、3位選擇性還原合成鵝去氧膽酸，總產(chǎn)率為26%，純度經(jīng)HPLC檢測(cè)為97.5%；再由鵝去氧膽酸經(jīng)選擇性氧化7位羥基、選擇性還原7位酮基合成熊去氧膽酸，產(chǎn)率為74%,熊去氧膽酸總產(chǎn)率為19%，純度經(jīng)HPLC檢測(cè)為96.2%。通過(guò)熔點(diǎn)、MS和1HNMR測(cè)定確證了各關(guān)鍵中間體及目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。合成工藝改進(jìn)后，原料豬去氧膽酸來(lái)源豐富易得，反應(yīng)條件溫和(不需要高溫高壓或低溫操作)，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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