梁 松，王 波，許 靜，董蘭蘭，王言言，趙 波，夏超明

血吸蟲病是以蟲卵誘發(fā)宿主肉芽腫反應及繼發(fā)纖維化為特征的免疫病理性疾病。血吸蟲病肝纖維化是一個機體纖維合成和基質(zhì)降解失衡的動態(tài)變化過程，可導致門靜脈高壓、肝硬化、腹水等并發(fā)癥[1-2]。HSCs的活化已被認為是肝纖維化發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，其活化、增殖以致發(fā)生表型和功能的改變，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，并大量合成以Ⅰ型、Ⅲ型膠原為主的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),超過了機體的降解能力，使ECM在肝內(nèi)過量沉積導致纖維化形成[3-4]。課題組前期研究已表明，ICOSL/ICOS信號介導的Th2極化與感染日本血吸蟲導致的肝纖維化有關[5-6]。在此基礎上，本實驗通過觀察ICOS-Tg小鼠原代HSCs活化及其對肝纖維化形成的影響，進一步探討ICOSL/ICOS信號在血吸蟲病肝纖維化中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 由揚州大學比較醫(yī)學中心提供遺產(chǎn)背景品系為FVB/NJ的ICOS-Tg小鼠，所有實驗小鼠均置于蘇州大學實驗動物中心SPF實驗動物大樓中飼養(yǎng)，采用自動溫度控制(22±1)℃，自動光控(12 h明/12 h暗)，自由進食及飲用潔凈水。日本血吸蟲尾蚴陽性釘螺購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.1.2試劑 Collagenase Type Ⅰ(Gibco)、Pronase E(Roche)、DNase Ⅰ(Sigma)、Optiprep細胞分離液(Axis-shield)、RPMI-1640培養(yǎng)基和低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、Triton X-100(Amresco)、Hepes和EGTA(Solarbio)、GFAP抗體和SABC-CY3(武漢博士德)、Trizol(Invitrogen)、DEPC水(上海生工生物)、PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)、TGF-β1，Ⅰ、Ⅲ型膠原、α-SMA mRNA和內(nèi)參基因β-actin mRNA(華大基因)等。

1.1.3主要儀器 津騰容劑過濾器和津騰隔膜真空泵GM-0.33A(天津津騰實驗設備有限公司)；BT-100型蠕動(恒流)泵YZ9901(上海青浦滬西儀器廠)；恒溫混勻儀TZL-200(蘇州帕西瓦爾實驗設備有限公司)；Olympus CX31顯微鏡(日本Olympus)；Olympus C-7070照相機(日本Olympus)；Eppendorf PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)；Step One Plus Real-Time PCR Systerm (美國ABI)；活細胞工作站(德國Leica)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus)；Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo)。

1.1.4主要試劑 灌注液Ⅰ：氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.402 g，二水磷酸二氫鈉0.093 6 g，十二水磷酸氫二鈉0.286 5 g，HEPES 2.383 g， EGTA 0.190 g，碳酸氫鈉0.352 8 g，葡萄糖0.901 g，pH7.2～7.4。灌注液Ⅱ：0.04% CollagenaseⅠ，加 RPMI-1640至100 mL，pH7.2～7.4。振蕩消化液： 0.08% CollagenaseⅠ，0.08% Pronase E， 5U/mL DNaseⅠ，加RPMI-1640至100 mL，pH7.2～7.4。所有溶液均需0.22 μm過濾除菌，并且在37℃培養(yǎng)箱中預熱后使用。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型的建立 將釘螺置于潔凈的去氯水中，25 ℃，光照下逸出日本血吸蟲尾蚴，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染15±1條尾蚴，實驗小鼠均在SPF級動物房飼養(yǎng)。

1.2.2HSCs的分離 腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠麻醉后，將其浸泡于75%酒精15 s，將其固定于解剖臺上，打開腹腔，暴露肝門靜脈，從門靜脈插管，灌注灌注液Ⅰ，同時剪短下腔靜脈，待肝臟變成土黃色后，更換灌注液Ⅱ進行灌注5～7 min，將肝臟游離至事先加入5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基的平皿中；繼續(xù)灌注，直至肝臟呈糜爛狀后停止灌注，撕除肝包膜，盡量撕碎肝組織，去除結締組織，將肝組織倒入裝有20 mL振蕩消化液的50 mL離心管中，37 ℃振蕩消化20～30 min；終止消化，200目尼龍篩網(wǎng)過濾，收集細胞懸液，400 r/min×6 min，取上清；2 000 r/min×6 min，棄上清，5 mL RPMI-1640洗滌兩次，之后加入1.5 mL RPMI-1640重新懸浮細胞，待用；于50 mL離心管中分別緩慢加入4 mL 16%梯度分離液、4mL 12%梯度分離液，最后小心加入上述細胞懸液；離心，4 000 r/min×20 min；吸取目的層細胞，加入RPMI-1640離心洗滌2次后重懸計數(shù)。

1.2.3HSCs的培養(yǎng) RPMI-1640重懸細胞后，然后以1×106個細胞接種于25 cm2透氣培養(yǎng)瓶中，含15%低糖DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后第1次換液，以后每48 h換培養(yǎng)液1次。

1.2.4分離細胞的鑒定

1.2.4.1臺盼藍計數(shù) 將適量洗滌好的細胞懸液用臺盼藍染色后，置于顯微鏡下觀察計數(shù)，計算細胞的成活率。

1.2.4.2小鼠原代HSCs自發(fā)熒光檢測 將分離出的新鮮小鼠HSCs置于培養(yǎng)皿中，應用倒置熒光顯微鏡相差模式觀察其細胞形態(tài)，并在波長為328nm的紫外激發(fā)光下觀察細胞藍綠色自發(fā)熒光。

1.2.4.3神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學實驗 將培養(yǎng)5 d的HSCs用兔抗小鼠GFAP(Glial fibrillary acidic protein )一抗、生物素化羊抗兔IgG二抗和SABC-Cy3進行免疫熒光染色，檢測GFAP表達，計算細胞的純度。

1.2.4.4原代HSCs總RNA抽提及cDNA的合成 將小鼠不同病期原代HSCs以1×106個/mL的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，15%低糖DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后收集細胞。細胞總RNA的抽提：參照MIQE法則確保實時熒光定量PCR檢測結果的準確[7]。將原代培養(yǎng)7 d HSCs培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒凈，用預冷的PBS 5 mL洗滌3 min，2次，加入1 mL預冷的TRIzol試劑，室溫靜置10 min，充分吹打至無明顯細胞團塊，使細胞充分裂解；將細胞裂解液轉(zhuǎn)入滅菌的無Rnase的帶蓋1.5 mL Ep管中，室溫靜置15 min；加入200 μL的氯仿，劇烈振蕩30 s后，室溫靜置5～10 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，使Ep管中液體分為3層，上層為含RNA水相，中間為DNA，下層為含蛋白質(zhì)的有機相，轉(zhuǎn)移上層水相至另一個新的滅菌無Rnase的帶蓋1.5 mL Ep管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻，室溫靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min。棄上清，沉淀中加入1mL -20 ℃預冷的75%酒精(DEPC水配制)洗滌除鹽，振蕩30 s，4℃、7 000 r/min離心5 min，2次。小心棄上清，再離心數(shù)秒，用滅菌無Rnase的槍頭吸去多余液體，空氣干燥10 min，用20 μL DEPC水溶解RNA沉淀。所有RNA樣品在Nanodrop 2000超微量分光光度計下測定其OD260/OD280的比值，范圍在1.8～2.0，以保證待測RNA濃度、純度及完整性。

每組取RNA 1μL進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，按PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書操作步驟進行，制備足夠的cDNA用作熒光定量PCR的模板。反應體系20：5×PrimeScript Buffer(for Real Time) 4 μL；PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1 μL；Oligo dT Primer(50 μm) 1μL；Random 6 mers(100 μm) 1 μL；RNA模板2 μL；RNase Free dH2O 11 μL；總體積20 μL。反轉(zhuǎn)錄后cDNA在Nanodrop 2000超微量分光光度計下測定其OD260/OD280的比值，然后每個樣本濃度稀釋成300 ng/μL作為定量模板，-80 ℃儲存。

1.2.4.5實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, qRT-PCR) qRT-PCR法采用SYBR染料在ABI Step One Plus Real-Time PCR Systerm上進行。PCR反應體系20 μL；體系內(nèi)含cDNA模板2 μL，SYBR Premis Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,dH2O 6.8 μL, 95 ℃，10 min;40個循環(huán)(95 ℃，15 s；60℃，1 min)。為了建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線，擴增反應結束后，95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s 。每個樣本重復測定3次。實驗所用的引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR檢測基因和內(nèi)參基因的引物

1.2.6標準曲線制作 將任意一感染周期原代HSCs的cDNA，進行5倍梯度稀釋，設定cDNA濃度300 ng/μL時為1，分別稀釋為1×5-1，1×5-2，1×5-3，1×5-4，1×5-5，1×5-6這幾個梯度濃度的cDNA樣本，每個濃度梯度設置三個復孔，qRT-PCR測定各基因的Ct值，繪制得到標準曲線。各基因的標準曲線方程見表2。

表2 基因標準曲線方程

2 結 果

2.1ICOS-Tg小鼠HSCs分離、鑒定及培養(yǎng)

2.1.1ICOS-Tg小鼠HSCs分離與鑒定 見1-A，為活細胞工作站下觀察HSCs形態(tài)(×400)。根據(jù)HSCs具有自發(fā)熒光的特性，倒置熒光顯微鏡在波長為328 nm的紫外激發(fā)光下觀察HSCs并拍照(圖1-B)，臺盼藍拒染法鑒定HSCs成活率在95%以上。小鼠原代HSCs培養(yǎng)至第5 d，進行HSCs特異性表達蛋白GFAP免疫熒光細胞化學染色，結果表明：HSCs細胞漿中呈現(xiàn)紅色熒光(圖1-D)，鑒定其分離純度為90%以上(顯微鏡下隨機取10個視野，計算所有GFAP陽性的細胞占所有細胞的比例，然后取平均值)。

2.1.2ICOS-Tg小鼠HSCs培養(yǎng) 如圖2，為倒置顯微鏡下分別于培養(yǎng)1 d、3 d、7 d后觀察新鮮分離的HSCs形態(tài)(光鏡×400)。剛分離的HSCs呈圓形，1 d后大多數(shù)細胞貼壁，呈圓形或橢圓形(圖2-A)；3 d后細胞體積增大，細胞開始伸展伸出偽足呈星形，并且細胞開始增殖(圖2-B)；7 d后細胞繼續(xù)伸展并增殖，絕大部分細胞呈星形，并且達到50%聚集(圖2-C)。

2.2ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲不同病期與HSCs活化相關基因α-SMA的表達 感染日本血吸蟲后，小鼠原代HSCs中α-SMA基因的表達水平自感染后4 w開始上升(0.706±0.012，gene/β-actin)，感染后6 w(0.954±0.010，gene/β-actin)、9 w(1.078±0.009，gene/β-actin)仍處于逐漸升高趨勢。ICOS-Tg小鼠HSCs中α-SMA基因的表達水平在感染后6 w(0.954±0.010vs0.843±0.011, gene/β-actin,▼P<0.01)、9 w(1.078±0.009vs0.947±0.011, gene/β-actin,▼P<0.01)顯著高于同時期野生型小鼠HSCs中的水平, 見圖3。

圖1肝星狀細胞(HSCs)的純度和活率鑒定

Fig.1Identificationoffreshlyisolatedhepaticstellatecells(HSCs)

A: Virtually all cells examined under light microscopy;

B: Immediately after cell isolation, exhibited characteristic autofluorescence under ultraviolet excitation at 328-nm wavelength;

C: Merge A and B;

D: Immunocytochemical staining demonstrates expression of GFAP, which was a specific marker of HSC not expressed in other liver cell types

Original magnification×400

圖2培養(yǎng)的原代肝星狀細胞(HSCs)于倒置顯微鏡下觀察(×400)

Fig.2PrimaryHSCsculturedonplasticfor1day(A),3days(B)or7days(C)

At each time point, cells were examined under phase contrast photomicrograph (Original magnification, ×400).

圖3ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中α-SMA基因的表達水平

(注：ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01。)

Fig.3Expressionofα-SMAgeneonHSCsofICOS-Tgmiceindifferentinfectionstages

ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01.

2.3ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲不同病期HSCs中與肝纖維化相關基因的表達

2.3.1ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中TGF-β1基因的表達 日本血吸蟲感染后，隨著病程的遷移，小鼠原代HSCs中TGF-β1基因的表達自感染后4 w、6 w、9 w呈逐漸升高趨勢(0.760±0.067～1.138±0.101，gene/β-actin)。ICOS-Tg小鼠原代HSCs中TGF-β1基因表達水平(0.724±0.009～1.138±0.101vs0.709±0.019～0.919±0.019, gene/β-actin)均高于同時期野生型小鼠的水平，且在感染后6 w(0.940±0.011vs0.795±0.008, gene/β-actin,▼P<0.01)、9 w(1.138±0.101vs0.919±0.019, gene/β-actin,●P<0.05)顯著升高，見圖4。

圖4ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中TGF-β1基因的表達水平

(注：ICOS-Tg vs FVB/NJ,●P<0.05，▼P<0.01。)

Fig.4ExpressionofTGF-β1geneonHSCsofICOS-Tgmiceindifferentinfectionstages

ICOS-Tg vs FVB/NJ,●P<0.05,▼P<0.01.

2.3.2ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中Collagen-Ⅰ基因的表達 日本血吸蟲感染后，隨著病程的遷移，小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅰ基因的表達自感染后4 w、6 w、9 w呈逐漸升高趨勢(0.621±0.106～1.093±0.027，gene/β-actin)。ICOS-Tg小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅰ基因表達水平(0.593±0.005～1.093±0.027 vs 0.551±0.007～0.832±0.013, gene/β-actin)均高于同時期野生型小鼠的水平，且在感染后6 w(0.931±0.018vs0.731±0.003, gene/β-actin,▼P<0.01)、9 w(1.093±0.027vs0.832±0.013, gene/β-actin,▼P<0.01)顯著升高, 見圖5。

2.3.3ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中Collagen-Ⅲ基因的表達 日本血吸蟲感染后，隨著病程的遷移，小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅲ基因的表達自感染后4 w、6 w、9 w呈逐漸升高趨勢(0.312±0.004～0.576±0.002，gene/β-actin)。ICOS-Tg小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅲ基因表達水平自感染后6 w(0.444±0.008vs0.347±0.003, gene/β-actin,▼P<0.01)、9 w(0.576±0.002vs0.446±0.013, gene/β-actin,▼P<0.01)顯著高于同時期野生型小鼠的水平, 見圖6。

3 討 論

血吸蟲導致的主要免疫病理病變是肝臟蟲卵肉ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01.

芽腫和肝纖維化[3,8]。急性期患者伴有發(fā)熱，腹瀉，血液中嗜酸性粒細胞增多等癥狀；慢性期患者以肝、脾腫大為主；晚期則以肝纖維化為主，可發(fā)展成為門靜脈高壓癥，巨脾和肝硬化。血吸蟲感染宿主后，所引發(fā)的免疫應答反應既有Th1型應答又有Th2型應答，但在感染的不同階段會引起宿主Th1/Th2亞群的免疫偏移，即由Th1型應答向Th2型應答轉(zhuǎn)變[9]。在血吸蟲感染早期，此時宿主體內(nèi)的免疫應答以Th1型應答為主，Th1型應答有利于殺傷侵入宿主體內(nèi)的血吸蟲童蟲，并對組織內(nèi)蟲卵肉芽腫的形成和發(fā)展具有抑制作用；而在血吸蟲產(chǎn)卵后，蟲卵抗原引起Th1型細胞凋亡，因此，Th2型免疫應答逐漸占據(jù)了優(yōu)勢，宿主的免疫應答逐漸由Th1型向Th2型極化偏移[10]。已有研究表明在血吸蟲感染小鼠慢性病變過程中共刺激分子ICOS高表達與宿主Th2極化密切相關[11-12,5]。目前研究認為，HSCs不僅是肝臟炎癥反應的靶細胞，同時也是關鍵的效應細胞，并且HSCs在肝臟的免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制中起到重要作用，HSCs可由特異性的T淋巴細胞亞群激活，同時HSCs還表現(xiàn)出抗原遞呈細胞刺激淋巴細胞增生與激活T細胞反應[13]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)促進HSCs活化增殖并促進其分泌HA[14]。提示Th亞群的極化可介導HSCs活化效應，影響纖維化的形成。

圖5ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中Collagen-Ⅰ基因的表達水平

(注：ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01。)

Fig.5Expressionofcollagen-ⅠgeneonHSCsofICOS-Tgmiceindifferentinfectionstages

ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01.

圖6ICOS-Tg小鼠感染不同病期HSCs中Collagen-Ⅲ基因的表達水平

(注：ICOS-Tg vs FVB/NJ,▼P<0.01。)

Fig.6Expressionofcollagen-ⅢgeneonHSCsofICOS-Tgmiceindifferentinfectionstages

本研究結果發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲感染小鼠HSCs中α-SMA基因表達水平自感染后4 w開始上升，感染后6 w、9 w仍處于上升趨勢且表達維持在較高水平。 有研究表明，運用基因芯片技術檢測日本血吸蟲感染小鼠HSCs的活化標記α-SMA在感染后3 w時就顯著升高，且持續(xù)高表達，說明HSCs在蟲卵沉積前即已開始活化[15]。類似研究證明，肝HSCs中α-SMA在感染后4周即表達開始上調(diào)[16]。HSCs的活化、增殖是肝纖維化的關鍵環(huán)節(jié)。α-SMA為HSCs活化的特征性標志其表達水平可一定程度反映HSCs的活化程度。本研究結果顯示，ICOS-Tg小鼠原代肝HSCs中與其活化相關的α-SMA基因的表達水平在感染后6w、9w顯著高于同時期野生型小鼠原代HSCs中水平(P<0.01)，提示上調(diào)共刺激信號ICOSL/ICOS促進肝HSCs的活化。

轉(zhuǎn)化生長因子β在脊椎動物體內(nèi)存在3種亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。其中TGF-β1是最強的致纖維化因子，在纖維化的起始和持續(xù)發(fā)展階段均發(fā)揮關鍵作用[17]。體內(nèi)和體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1對肝纖維化發(fā)展的中心環(huán)節(jié)—肝星狀細胞(HSCs)的活化起著關鍵的調(diào)節(jié)作用[18]。在HSCs活化過程中，TGF-β1觸發(fā)多個信號通路，包括：Smad通路[18]，ERK1/2通路[19]和p38 MAPK通路[20]，也有研究表明，TGF-β1通過β-catenin途徑下調(diào)PPAR-γ的表達，從而增加膠原和TIMPS的表達，最終促進肝纖維化發(fā)生[21]。本研究運用qRT-PCR法檢測感染日本血吸蟲小鼠原代肝HSCs中Th2型細胞因子TGF-β1表達水平表明，隨著病程的遷移，ICOS-Tg小鼠原代HSCs中TGF-β1表達水平在感染后6 w、9 w顯著高于同時期野生型小鼠原代HSCs中水平(P<0.01～0.05)，同時，檢測ICOS-Tg小鼠原代HSCs中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ基因表達水平在感染后6 w、9 w也顯著高于同時期野生型小鼠原代HSCs的水平(P<0.01)。提示上調(diào)ICOSL/ICOS信號可增強HSCs中TGF-β1基因的表達，促進HSCs的活化及纖維化相關因子的上調(diào)表達，導致纖維化形成。

本研究應用ICOS-Tg小鼠血吸蟲病模型，初步證明，ICOSL/ICOS信號可上調(diào)HSCs活化效應介導肝纖維化的形成，為深入闡明日本血吸蟲感染宿主纖維化形成的機制，尋找下調(diào)或抑制血吸蟲病肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的有效途徑提供科學依據(jù)。

參考文獻：

[1]Domling A, Khoury K. Praziquantel and schistosomiasis[J]. ChemMedChem, 2010, 5(9): 1420-1434. DOI: 10.1002/cmdc.201000202

[2]Liu Z, van Grunsven LA, Van Rossen E, et al. Blebbistatin inhibits contraction and accelerates migration in mouse hepatic stellate cells[J]. British J Pharmacol, 2010, 159(2): 304-315. DOI: 10.1111/j.1476-5381.2009.00477.x

[3]Burke ML, Jones MK, Gobert GN, et al. Immunopathogenesis of human schistosomiasis[J]. Parasit Immunol, 2009, 31(4): 163-176. DOI: 10.1111/j.1365-3024.2009.01098.x

[4]Anthony B, Mathieson W, de Castro-Borges W, et al.Schistosomamansoni: egg-induced downregulation of hepatic stellate cell activation and fibrogenesis[J]. Exper Parasitol, 2010, 124(4): 409-420. DOI: 10.1016/j.exppara.2009.12.009

[5]Wang Y, Wang B, Liang S, et al. Immune response and immunopathology in ICOSL knockout mice infected withSchistosomajaponicum[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28(8): 769-775.

王瑜, 王波, 梁松, 等. ICOSL 敲基因小鼠日本血吸蟲病模型的免疫應答及其免疫病理(英文)[J]. 中國人獸共患病學報, 2012, 28(8) : 769-775.

[6]Wang R, Cai R, Wang B, et al. Effect of immune response mediated by ICOS signaling pathway on hepatic fibrosis in mice infected withSchistosomajaponicum[J]. Chin J Parasit Dis, 2013, 31(005): 329-336. (in Chinese)

王瑜, 蔡茹, 王波, 等. 可誘導共刺激分子信號介導的免疫應答對血吸蟲性肝纖維化形成的影響[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2013, 31(005): 329-336.

[7]Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments[J]. Clin Chem, 2009, 55(4): 611-622. DOI: 10.1373/clinchem.2008.112797

[8]Tao FF, Yang YF, Wang H, et al. Th1-type epitopes-based cocktail PDDV attenuates hepatic fibrosis in C57BL/6 mice with chronicSchistosomajaponicuminfection[J]. Vaccine, 2009, 27(31): 4110-4117.DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.04.073

[9]Xu X, Wen X, Chi Y, et al. Activation-induced T helper cell death contributes to Th1/Th2 polarization following murineSchistosomajaponicuminfection[J]. J Biomed Biothechnol, 2010, 2010: 202397. DOI: 10.1155/2010/202397

[10]Lundy SK, Boros DL. Fas ligand-expressing B-1a lymphocytes mediate CD4+-T-cell apoptosis during schistosomal infection: induction by interleukin 4 (IL-4) and IL-10[J]. Infect Immun, 2002, 70(2): 812-819.

[11]Wang Y, Cai R, Wang B, et al. Effects ofSchistosomajaponicuminfection on the CD28/CD86 signaling pathway and Th1/Th2 polarization in ICOS transgenic mice[J]. J China Med Univ, 2013, 42(6): 494. (in Chinese)

王瑜, 蔡茹, 王波, 等. ICOS 轉(zhuǎn)基因小鼠感染日本血吸蟲對 CD28/CD86 表達及 Th1/Th2 極化的影響[J]. 中國醫(yī)科大學學報, 2013, 42(6): 494.

[12]Li Y, Zhang HQ, Gong W, et al. Effect and expression of costimulatory molecules on regulating Th1/Th2 polarization on mice infected withSchistosomajaponicum[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(9): 799-804. (in Chinese)

李穎, 張惠琴, 龔維, 等. 日本血吸蟲感染小鼠CD4+T淋巴細胞協(xié)同刺激分子表達譜及其在介導Th1/Th2極化中的作用[J]. 中國人獸共患病學報, 2010, 26(9): 799-804.

[13]Winau F, Hegasy G, Weiskirchen R, et al. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses[J]. Immunity, 2007, 26(1): 117-129.

[14]Lu XJ, Chen YP, Yang T, et al. The influence of regulatory T cells in hepatic stellate cell proliferation and HA secretion[J]. J Clin Hepathol, 2012, 28(1): 39-43. (in Chinese)

陸小蒟, 陳永平, 陽韜, 等. 調(diào)節(jié)性 T 細胞對肝星狀細胞增殖及透明質(zhì)酸分泌的影響[J]. 臨床肝膽病雜志, 2012,28(1):39-43.

[15]Luo J. Characteristics of the gene expression profiles of hepatic stellate cells in mice infected withSchistosomajaponicumand functions of vascular endothelial growth factor in liver fibrosis of schistosomiasis[D]. Nanjing: Nanjing Medical University, 2011. (in Chinese)

羅潔. 日本血吸蟲感染小鼠肝星狀細胞的基因表達譜特征及血管內(nèi)皮生長因子旁分泌作用對肝星狀細胞的影響[D]. 南京醫(yī)科大學, 2011.

[16]Yang YH, Cai WM, Jin GL, et al. Studies on the relationship between granuloma and hepatic fibrosis in the infection ofSchistosomajaponicum[J]. Chin J Schist Ctrl, 1999, 11(6): 321-323. (in Chinese)

楊艷宏, 蔡衛(wèi)民, 金國梁，等. 日本血吸蟲蟲卵肉芽腫與肝纖維化關系的研究[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 1999, 11(6): 321-323.

[17]Herbst H, Wege T, Milani S, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and-2 RNA expression in rat and human liver fibrosis[J]. Am J Pathol, 1997, 150(5): 1647. DOI:10.1053/jhep.2000.20521

[18]Inagaki Y, Okazaki I. Emerging insights into transforming growth factor β Smad signal in hepatic fibrogenesis[J]. Gut, 2007, 56(2): 284-292. DOI: 10.1136/gut.2005.088690

[19]Liu Y, Wen XM, Lui Elh, et al. Therapeutic targeting of the PDGF and TGF-β-signaling pathways in hepatic stellate cells by PTK787/ZK22258[J]. Lab Investigat, 2009, 89(10): 1152-1160. DOI: 10.1038/labinvest.2009.77

[20]Ohyama T, Sato K, Kishimoto K, et al. Azelnidipine is a calcium blocker that attenuates liver fibrosis and may increase antioxidant defence[J]. British J Pharmacol, 2012, 165(4b): 1173-1187. DOI: 10.1111/j.1476-5381.2011.01599.x

[21]Qian J, Niu M, Zhai X, et al. β-Catenin pathway is required for TGF-β1 inhibition of PPARγ expression in cultured hepatic stellate cells[J]. Pharmacol Res, 2012, 66(3): 219-225. DOI: 10.1016/j.phrs.2012.06.003