陳秀蘭

(咸寧市中心醫(yī)院口腔科，湖北咸寧437100)

齲病俗稱蟲牙、蛀牙，是細菌性疾病，可以繼發(fā)牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和頜骨炎癥。如不及時治療，病變繼續(xù)發(fā)展，形成齲洞，終至牙冠完全破壞消失，其發(fā)展的最終結(jié)果是牙齒喪失。齲病特點是發(fā)病率高，分布廣?，F(xiàn)已證實，變形鏈球菌(S.mutans)是引起齲齒的重要病原菌，其通過粘附于牙面獲得性膜上，繁殖、產(chǎn)酸，溶解牙體硬組織，形成齲洞。茶多酚是茶葉中一類以兒茶素為主體的多酚類化合物，是茶葉水溶液提取物的主要成分。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體，是茶多酚生物活性的主要成份。研究顯示，綠茶中兒茶素對引起人體致病的部分細菌有抑制效果，本實驗的目的就是研究綠茶提取物茶多酚對變形鏈球菌生長、產(chǎn)酸能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 EGCG購自Sigma公司，變形鏈球菌購自武漢大學口腔醫(yī)學院口腔醫(yī)學工程教育部重點實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗菌液的準備 細菌復蘇及培養(yǎng):將變形鏈球菌干菌株復蘇并接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion，BHI)，在37℃厭氧環(huán)境下(CO210%、N290%)培養(yǎng)48h，經(jīng)形態(tài)學鑒定后挑取接種于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h增菌，使用BHI液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度，使其達到5×106CFU/ml，備用。

1.2.2 抗菌藥物EGCG混懸液的配制 EGCG用BHI液體培養(yǎng)基配制成0.1%的母液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌后于4℃避光保存，使用前按設(shè)定濃度(100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5 mg/L)用BHI培養(yǎng)基稀釋后使用。

1.2.3 抑菌環(huán)試驗接種 取直徑為5mm的無菌干燥的濾紙，滴加EGCG混懸液20μl，將濾紙片平放于清潔的無菌平皿中，置室溫下自然干燥備用。陰性對照樣片的制備方法相同，只是滴加的是同等體積的無菌生理鹽水。以無菌棉分別蘸取已制備好的變形鏈球菌液均勻涂布于BHI瓊脂平板表面，涂布4次，每次旋轉(zhuǎn)平板 90°，最后沿平板邊緣涂抹1圈，置室溫干燥5 min。用無菌鑷子將含不同濃度藥紙物的紙片貼于含菌平板上。將平板置37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，用游標卡尺測量培養(yǎng)皿中的圓形抑菌區(qū)域直徑并取得平均值。

1.2.4 EGCG對變形鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)用BHI培養(yǎng)液按液體二倍稀釋法進行等倍稀釋，配制濃度為 100、50、25、12.5、6.25、3.13mg/L各9ml置于無菌試管中。在每管中加入1ml菌懸液，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。陰性對照組試管中為BHI培養(yǎng)基9ml，1ml菌液，空白對照組試管中為10ml BHI培養(yǎng)基。每組5個平行樣。以肉眼觀察藥物最低濃度管無細菌生長者，即為受試菌的最低抑菌濃度。

1.2.5 EGCG對變形鏈球菌的產(chǎn)酸抑制作用根據(jù)EGCG對變形鏈球菌的MIC測定結(jié)果，選取MIC值以下的4個濃度(1、1/2，1/4和1/8 MIC)，配制成含1%蔗糖的BHI培養(yǎng)液，對照組為不含EGCG的BHI培養(yǎng)基，每組5個平行樣。采用精密pH計調(diào)定初始pH為7.4，各組按菌懸液和BHI液體培養(yǎng)基1∶10比例接種等量菌懸液，厭氧培養(yǎng)48h，測定上清液pH值，每管測定3次，結(jié)果取平均值，并計算pH變化值(△pH)。

1.3 統(tǒng)計學分析 各濃度藥物對細菌產(chǎn)酸抑制作用的研究數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，多組均數(shù)間比較選用單因素方差分析，多組間均數(shù)兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度EGCG對變形鏈球菌的抑菌圈大小 結(jié)果顯示 100mg/L、50mg/L、25mg/L和12.5mg/L EGCG對變形鏈球菌的抑菌圈的直徑大小分別為14.02±0.98、12.98±0.77、11.54±0.62和10.12±0.37mm。單因素方差分析及LSD-t檢驗結(jié)果顯示均數(shù)間兩兩比較差異存在顯著性(P＜0.05)。

2.2 肉眼觀察EGCG對變形鏈球菌的最低抑菌肉眼觀察EGCG對變形鏈球菌的最低抑菌濃度為6.25 mg/L。

2.3 不同濃度EGCG對變形鏈球菌產(chǎn)酸的抑制作用 結(jié)果顯示兩實驗組(6.25 mg/L、3.13mg/L)△pH值均小于對照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。并且多組間均數(shù)兩兩比較顯示6.25 mg/L、3.13mg/L兩組之間差異存在顯著性(P＜0.05)。

3 討論

茶是我國最早發(fā)現(xiàn)的中草藥之一。中醫(yī)認為，綠茶性苦寒，具清熱解毒，去火降暑 、利尿消炎、消毒殺菌和止渴生津的功效［1］。綠茶提取物的主要成分包括茶多酚、碳水化合物以及多種維生素等，EGCG是茶多酚最主要的活性成分。目前許多研究證實，綠茶提取物具有降血壓、抗凝血、降血糖、減肥、防治動脈粥樣硬化、預防皮膚過敏效應等多種藥理功能。除此之外，還能預防齲齒、牙周炎、口臭等功效［2］。埃及科學家在2008年3月舉行的普通微生物學第162次會議上說，飲綠茶可幫助抗菌素殺傷對抗菌素有極強耐受性的超級細菌，使這些抗菌素效力提高3倍以上。報告顯示接受抗菌素時喝綠茶是耐受菌，甚至是超級耐受菌對幾乎所有受試抗菌素的抵抗力降低。本實驗證實綠茶提取物EGCG具有抑制齲齒主要病原菌變形鏈球菌增殖的作用。抑菌圈實驗結(jié)果表明EGCG對變形鏈球菌有顯著的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑菌圈直徑越大，提示藥物濃度與抑菌作用呈正相關(guān)趨勢。最低抑菌濃度為6.25 mg/L，說明當只要藥物濃度≥6.25 mg/L就能顯著抑制變形鏈球菌的增殖。除此之外，本實驗還檢測了不同濃度EGCG對變形鏈球菌產(chǎn)酸能力的影響。結(jié)果顯示當濃度≥3.13mg/L時，EGCG對變形鏈球菌產(chǎn)酸有一定的抑制作用，當藥物濃度≤1.56mg/L時，實驗組與對照組的△pH相比較差異沒有統(tǒng)計學意義。

由此可見，綠茶提取物EGCG具有顯著抑制變形鏈球菌增殖、產(chǎn)酸的作用。EGCG可能是一種潛在的天然抗菌、防齲藥物。中國是產(chǎn)茶大國，以茶葉為原料提取茶多酚極具特色和優(yōu)勢，作為茶葉生產(chǎn)的新型副產(chǎn)品，具有相當大的經(jīng)濟效益。

［1］顧謙，陸錦時，葉寶存.茶葉化學［M］.合肥:中國科學技術(shù)大學出版社，2005:348

［2］孫樹國.綠茶提取物市場前景廣闊［J］.食品開發(fā)，2013，28(2):42