趙永騰，李濤，徐軍偉，趙鵬，余旭亞

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650500）

微藻碳水化合物生產(chǎn)生物燃料的研究進展

趙永騰，李濤，徐軍偉，趙鵬，余旭亞

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650500）

化石能源的不可再生性和使用過程中造成的環(huán)境污染使開發(fā)新能源變得非常迫切。微藻因為生長速度快，固定二氧化碳能力強，碳水化合物積累量高，近年來成為生物燃料生產(chǎn)的研究熱點。微藻碳水化合物制備生物燃料極具潛力，但規(guī)?；囵B(yǎng)為制約其發(fā)展的瓶頸。本文總結(jié)了微藻碳水化合物的組成及代謝，介紹了微藻碳水化合物的酶水解、化學(xué)和超聲等預(yù)處理方法，比較分析了酶糖化和化學(xué)糖化特點，簡述了傳統(tǒng)的厭氧消化、活性污泥發(fā)酵技術(shù)用于微藻碳水化合物制備生物燃料的循環(huán)利用優(yōu)勢，對微藻碳水化物制備生物液、氣態(tài)燃料的研究進展、經(jīng)濟性和產(chǎn)業(yè)化前景進行了綜述。提出了微藻碳水化合物制備生物燃料需要以更經(jīng)濟、有效的糖化和發(fā)酵技術(shù)為未來研發(fā)方向。

微藻；碳水化合物；發(fā)酵；生物燃料

Key words：microalgal；carbohydrates；fermentation；biofuel

由于化石燃料的開采使用使得環(huán)境污染、經(jīng)濟問題日益嚴峻，研發(fā)清潔、可再生能源變得尤為重要，特別是發(fā)展中國家，新能源需求更為迫切[1]。用于生產(chǎn)生物柴油后的微藻藻渣仍含有一定量的蛋白質(zhì)和碳水化合物，可利用這些蛋白質(zhì)和碳水化合物發(fā)酵來生產(chǎn)生物燃料[2]。作為傳統(tǒng)化石燃料的替代能源，乙醇、氫氣、甲烷等燃燒時只產(chǎn)生水和二氧化碳，是較為清潔的生物燃料[3]。本文就微藻中碳水化合物的組成、代謝以及微藻碳水化合物預(yù)處理、糖化和發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料等研究進行了總結(jié)。

1 微藻中的碳水化合物

1.1 微藻中碳水化合物組成

微藻的細胞壁分為內(nèi)層細胞壁和外層細胞壁，總體可分為3部分，胞間層、初生壁和次生壁。外層的細胞壁成分因藻種的不同而形態(tài)各異，通常由多糖組成，例如果膠、瓊脂和藻酸鹽。微藻細胞壁內(nèi)層主要是纖維素、半纖維素和其他物質(zhì)[4]。淀粉和多糖都可以轉(zhuǎn)化為微生物發(fā)酵產(chǎn)乙醇所需的糖。

1.2 微藻中碳水化合物代謝

微藻中碳水化合物的積累源于微藻吸收二氧化碳進行光合作用，這一生物反應(yīng)過程即卡爾文循環(huán)，通過ATP/NADPH將空氣中的二氧化碳轉(zhuǎn)化為葡萄糖和其他糖[5]。研究表明，三磷酸甘油不僅是合成三?；视偷那绑w，也用于合成葡萄糖，故微藻油脂和淀粉的合成存在競爭關(guān)系。因此，為了提高碳水化合物類微藻生產(chǎn)生物燃料的產(chǎn)量，就必須研究和調(diào)控微藻碳水化合物積累、代謝，如增加葡聚糖的積累和減少淀粉的降解[6]。

除了細胞質(zhì)體內(nèi)的淀粉外，微藻細胞壁上還存在另一個富含碳水化合物的區(qū)域。微藻種類不同，其細胞壁成分各異，其中纖維素是綠藻中最主要的碳水化合物。纖維素合成是一個較為復(fù)雜的過程，包括很多酶解反應(yīng)。合成纖維素的原始底物為UDP-葡萄糖，而UDP-葡萄糖是在蔗糖合酶的作用下催化UDP和果糖反應(yīng)的產(chǎn)物[7]。

2 微藻作為生產(chǎn)生物燃料的原料的特點

生物燃料生產(chǎn)的傳統(tǒng)原料一般為糖、谷物和含油作物。糖和淀粉類原料很容易發(fā)酵而且具有很高的生物燃料轉(zhuǎn)化率。然而，受到地域和氣候的限制，又因大部分谷物和植物油脂要用于全球日益增多的人和牲畜的食物，故傳統(tǒng)生物燃料生產(chǎn)的原料受到很大限制[8-10]。通過木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物燃料比用糖和淀粉類谷物更經(jīng)濟，但若要達到大規(guī)模生產(chǎn)仍需5～10年的發(fā)展[11]，且需要大量的可耕種土地甚至山區(qū)土地來培養(yǎng)草本能源植物。

然而，微藻可以通過很好的光合作用效率來解決這一問題，與其他生物質(zhì)相比，微藻細胞的光合作用可較易獲得生物質(zhì)[12]。一些微藻在細胞壁中包含大量的碳水化合物和質(zhì)體[13]，這些均可作為發(fā)酵的底物。此外，一些藻種在特定條件下可以積累大量的油脂作為制備生物柴油的原料[14]。利用微藻作為生物燃料的原料比傳統(tǒng)原料有很多優(yōu)勢，微藻生長較快且生物量大[15]。微藻碳水化合物中木質(zhì)素和半纖維素的含量較低，如微藻Chlorococumsp.生物質(zhì)用于發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇[1]，減少預(yù)處理。微藻在生長過程中可以有效利用二氧化碳，減少溫室氣體的排放，可利用海藻固定二氧化碳和油脂的生產(chǎn)[16]，以及利用微藻C. vulgaris固定二氧化碳和生產(chǎn)生物乙醇[17]。微藻對生存環(huán)境要求不嚴，既可生長在淡水也可在海水中，如海洋微藻Nannochloropsissp. F&M-M24和Tetraselmis suecicaF&M-M33用于生產(chǎn)油脂[18]，此外其副產(chǎn)品可作為其他生物煉制的原料。簡言之，微藻是一種有效、可循環(huán)利用、可再生的生物燃料原料。但是，微藻的培養(yǎng)規(guī)模以及微藻的生長速率是制約微藻工業(yè)化發(fā)展的瓶頸[19]。之前的藻類油脂產(chǎn)品主要局限于具有營養(yǎng)價值的脂肪酸， 而不是用于生產(chǎn)生物燃料。并且只有少數(shù)種類的藻類投入了商業(yè)生產(chǎn)， 因而對于微藻大規(guī)模培養(yǎng)的可借鑒性數(shù)據(jù)十分有限。此外，微藻采集過程相對繁瑣，微藻生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料的技術(shù)欠佳[20]，生產(chǎn)成本也相對較高。因此要從提高生物燃料產(chǎn)率和降低生產(chǎn)成本上開展重點研究。

3 微藻中碳水化合物生產(chǎn)生物燃料的工藝

3.1 預(yù)處理

將微藻中的油脂提取之后，可以利用酶水解、熱堿和超聲等對其進行預(yù)處理，再發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料。Ellis等[21]研究利用廢水培養(yǎng)的Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4微藻生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮-丁醇-乙醇，他們發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理和酶水解可以有效的提高丙酮、丁醇和乙醇混合物（ABE）的產(chǎn)量，當(dāng)加入1% 葡萄糖時ABE的總產(chǎn)量可以提升1.6倍，ABE最高的產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為0.311 g/g和0.102 g/(L·h)。而通過熱堿在100 ℃下預(yù)處理提油后的微藻藻渣，1 g微藻藻渣可得到的最高氫氣產(chǎn)量為45.54 mL，產(chǎn)氫量比未經(jīng)預(yù)處理的微藻藻渣提高3倍[3]?；瘜W(xué)預(yù)處理可將微藻生物質(zhì)中的碳水化合物轉(zhuǎn)化為糖從而來生產(chǎn)生物乙醇。如在110 ℃用3%的硫酸預(yù)處理微藻30 min，葡萄糖的產(chǎn)量為28.5 g/L，產(chǎn)率達到95%，而直接進行分開酵素水解和發(fā)酵的微藻，生物乙醇產(chǎn)量僅為29.2%[22]。由此可見，在進行微藻生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生物燃料之前，通過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以提高生物燃料的產(chǎn)率。

3.2 糖化

微藻生物質(zhì)碳水化合物的主要成分為纖維素和淀粉，為了提高微藻中碳水化合物的利用率，需分解纖維素分子，水解葡聚糖單體的β-1-4-糖苷鍵和淀粉中的α-1-4-糖苷鍵。微藻的糖化與木質(zhì)纖維素糖化相類似，差別在于微藻生物質(zhì)缺乏木質(zhì)纖維素，可進行簡單的預(yù)處理[1]。無機酸、堿、酶和經(jīng)過加壓的熱水都可以將微藻中的糖分離出來[23]，總體上可分為兩類，酶糖化和化學(xué)糖化。纖維二糖酶、淀粉酶和葡萄糖糖化酶可用于水解微藻來獲得發(fā)酵糖。由于微藻中的纖維素都存在于細胞壁內(nèi)層，而且只有少量的半纖維素，無木質(zhì)素，所以在酶糖化過程中無需木素降解酶和木聚糖酶。另外，較其他木質(zhì)纖維素糖化過程，藻類的纖維素糖化無需要酸、堿或者蒸氣的預(yù)處理，更簡單經(jīng)濟。在水解微藻中的纖維素時，內(nèi)切型β-1-4-葡聚糖酶將纖維素分解為小片段，而后外切型β-1-4-葡聚糖酶將這些小片段分解為纖維二糖和纖維糊精，最終在β-糖苷酶的作用下將這些纖維寡糖降解為葡萄糖[24]。微藻細胞中的淀粉降解過程為，淀粉酶先水解淀粉內(nèi)的α-1-4-糖苷鍵產(chǎn)生糊精，再在葡糖糖化酶的作用下水解為葡萄糖和麥芽糖等。與化學(xué)水解相比，酶解具有能耗低、反應(yīng)條件溫和、葡萄糖產(chǎn)率高、無影響發(fā)酵的副產(chǎn)物產(chǎn)生等優(yōu)點[25]。Choi等[26]探究了兩種不同的酶對碳水化合物含量59.7% 的Chlamydomonas reinhardtii微藻生物質(zhì)產(chǎn)生物乙醇的影響，結(jié)果表明， pH值4.5、溫度55 ℃時反應(yīng)30 min，糖和微藻生物質(zhì)轉(zhuǎn)化率到達0.57 g/g，并且在分開酵素水解和發(fā)酵過程中產(chǎn)生物乙醇有很高的效率?；瘜W(xué)糖化特點是反應(yīng)速度快，但通常反應(yīng)條件強烈，需高溫、高壓、強酸、強堿等，在反應(yīng)過程中還會產(chǎn)生糠醛和5-羥甲基糠醛等副產(chǎn)物，它們不僅會抑制發(fā)酵產(chǎn)生物乙醇，還會增加下游廢水處理的成本，所以必須選擇合適的條件來減少抑制型副產(chǎn)物的產(chǎn)生并提高反應(yīng)效率[27]。0.75% 的氫氧化鈉于120 ℃處理C. Infusionum30 min，每克微藻生物質(zhì)最終可產(chǎn)0.35 g糖[1]。此外，3% 硫酸于100 ℃水解微藻生物質(zhì)30 min，糖最高得率為95%[28]。這些研究結(jié)果表明，化學(xué)水解微藻生物質(zhì)產(chǎn)糖從而生產(chǎn)生物乙醇已經(jīng)較為成熟，且通過化學(xué)糖化微藻生物質(zhì)產(chǎn)糖從而轉(zhuǎn)化為生物乙醇具有更高的效率，而且更加簡單和經(jīng)濟。但是利用酸堿水解時糖的產(chǎn)量可能低于酶糖化時糖的產(chǎn)量。

3.3 微藻中碳水化合物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料

微藻可以積累豐富的油脂或碳水化合物，從而可以用來生產(chǎn)生物燃料，如乙醇、丁醇等液態(tài)燃料和氫氣、甲烷等氣態(tài)燃料[29-30]。在對微藻生物質(zhì)進行一定的預(yù)處理之后，多采用油脂提取后的微藻藻渣進行傳統(tǒng)的消化、活性污泥發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)生物燃料。此外，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的二氧化碳足以維持微藻的生長和碳水化合物的積累，碳水化合物豐富的微藻再用于發(fā)酵產(chǎn)生物乙醇的原料，這樣就可以有效的減少二氧化碳的排放并提高二氧化碳的重復(fù)利用率。如利用微藻C. vulgaris的生物質(zhì)作為原料生產(chǎn)發(fā)酵生物乙醇，乙醇得率可達到65%[17]。綠藻Dunaliella tertiolecta和C. reinhardtiiwere發(fā)酵生產(chǎn)氫氣，氫氣的最大得率分別為61% 和25%[31]。利用微藻生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料，雖然發(fā)酵的時間短、減少了外部微生物的污染，但仍需提高轉(zhuǎn)化階段的生產(chǎn)率以及降低生產(chǎn)成本[32]。

3.3.1 液態(tài)生物燃料

富含碳水化合物的微藻作為生產(chǎn)生物乙醇的原料，在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中會產(chǎn)生大量二氧化碳，可用來培養(yǎng)碳水化合物豐富的微藻[33]。此外，在微藻中碳水化合物的含量通常高于油脂含量，但后者的積累需要復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過程，而碳水化合物的生產(chǎn)易通過光合作用實現(xiàn)[6]，這也是利用微藻生產(chǎn)生物乙醇優(yōu)于生物柴油之所在。

淀粉是微藻細胞中最主要的碳水化合物，比如Chlorella，Dunaliella，Chlamy-domonas和Scenedesmus等藻種細胞干重淀粉量超過50%[34]。酶水解法仍是淀粉類微藻發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇采用的水解方法。微藻生物質(zhì)作為初始原料，可以充分利用現(xiàn)有的技術(shù)和設(shè)備。除了作為原料外，微藻細胞中的淀粉在無光照和無氧條件下可直接轉(zhuǎn)化為乙醇，盡管生物乙醇的產(chǎn)率和產(chǎn)量都比較低[35]，這種反應(yīng)能有效地解釋微藻細胞在黑暗條件下還能進行光和作用基本代謝的原因，而不僅僅把注意力集中在生物乙醇的實際運用上。Choi等[26]證明通過分開酵素水解和發(fā)酵C. reinhardtii UTEX90，1 g生物質(zhì)可以產(chǎn)0.23 g生物乙醇。化學(xué)糖化通常有較高的產(chǎn)糖率，但是水解含糖微藻生物質(zhì)時在預(yù)處理階段必須消除一些對發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用的副產(chǎn)物。

丁醇是用微藻中碳水化合物生產(chǎn)的另一種液態(tài)燃料?，F(xiàn)在生產(chǎn)丁醇最常用的的方法是以石油為原料進行化學(xué)合成[36]，很多學(xué)者致力于利用傳統(tǒng)碳源像生產(chǎn)乙醇一樣生產(chǎn)生物丁醇。但是與生物乙醇相比，發(fā)酵生產(chǎn)丁醇效率和產(chǎn)量都比較低，這主要是由于現(xiàn)有的代謝途徑生產(chǎn)生物丁醇時產(chǎn)生了一些具有抑制作用的副產(chǎn)物，尤其是丙酮、乙醇和其他有機酸[37]。理論上，如果能保證發(fā)酵副產(chǎn)物僅為二氧化碳和氫氣，那么生物丁醇的最大產(chǎn)率為每克葡萄糖可生產(chǎn)0.41 g丁醇，即使這樣仍然低于生產(chǎn)乙醇的理論產(chǎn)量。

通過丁醇梭菌的糖化結(jié)果看，與生產(chǎn)生物乙醇相比，利用微藻細胞中淀粉生產(chǎn)生物丁醇的過程相對簡單。在丁醇梭菌存在下，糖化生產(chǎn)丁醇時無需用淀粉酶使淀粉液化，也不用葡糖糖化酶糖化糊精。利用微藻碳水化合物生產(chǎn)生物丁醇的研究進展有限，而多見于利用海藻生產(chǎn)丁醇的報道[38]。除了可以利用微藻中淀粉轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物丁醇外，微藻中的纖維素在水解過程也可以轉(zhuǎn)化為丁醇。但是目前為止還沒有利用微藻生物質(zhì)中的纖維素生產(chǎn)生物丁醇的報道。在丁醇梭菌的存在下通過發(fā)酵含有淀粉和纖維素的微藻生物質(zhì)有可能會使生物丁醇的產(chǎn)量呈上升趨勢[39]。

3.3.2 氣態(tài)燃料

除了利用微藻中碳水化合物生產(chǎn)液態(tài)燃料外，氣態(tài)燃料，如甲烷、氫氣也可以通過有氧或者無氧發(fā)酵微藻生物質(zhì)來生產(chǎn)。甲烷發(fā)酵通過有機廢物或者是廢水，特別是復(fù)雜材料的降解物來厭氧消化，因此微藻生物質(zhì)也可以作為一種合適的甲烷發(fā)酵底物，但是產(chǎn)氫效率非常低[40]。

與利用谷物類原料一樣，微藻生物質(zhì)也可用來生產(chǎn)甲烷。木薯發(fā)酵產(chǎn)生物乙醇的有機廢棄物可用來厭氧消化制取甲烷，微藻藻渣也可以用來生產(chǎn)甲烷，甲烷的含量超過60%，所產(chǎn)生的硫含量少，降低了對反應(yīng)器的腐蝕[41]。共同消化微藻生物質(zhì)和廢紙可以提高甲烷產(chǎn)量[42]。此外，將其他有機材料和微藻生物質(zhì)共同消化可以提高它們的消化效率。

氫氣是通過消化微藻生物質(zhì)來生產(chǎn)另一種氣態(tài)燃料。作為高效、清潔能源，氫氣已逐步發(fā)展成為新的能源載體，特別是作為燃料可以直接用來發(fā)電[43]。近來，已有較多研究關(guān)注利用微藻生產(chǎn)沼氣[44]。然而，值得一提的是，單純厭氧消化過程制取氣態(tài)燃料不具有經(jīng)濟競爭力，應(yīng)考慮產(chǎn)出微藻高等級的生物燃料后（如生物乙醇、生物柴油和生物丁醇），再次利用微藻藻渣進行開發(fā)利用，形成微藻生物煉制的完整閉環(huán)[45]。

利用微藻生產(chǎn)生物燃料的經(jīng)濟可行性是決定市場的需求量和社會的認可度。微藻生物燃料要與化石燃料具有競爭性，除了具有自身的優(yōu)勢外，還需要降低生產(chǎn)的成本和節(jié)約能源的投入。微藻的生產(chǎn)成本取決于生產(chǎn)的規(guī)模和生產(chǎn)體系，就目前看微藻生物燃料的成本無法與其他化石燃料相比，且其價格較高于化石燃料。這樣就導(dǎo)致市場的需求量不高，加之政府的支持不夠，無法推動微藻生產(chǎn)生物燃料的發(fā)展，最終無法產(chǎn)業(yè)化[46-47]。要想使其產(chǎn)業(yè)化，應(yīng)將技術(shù)改進與篩選優(yōu)良菌種想結(jié)合，同時利用遺傳與代謝工程改造微藻的生理和代謝途徑，這樣才能對提高微藻生產(chǎn)生物燃料的經(jīng)濟可行性具有重要作用[6]。

4 總結(jié)與展望

在合適的培養(yǎng)條件下，微藻細胞可以積累超過50% 的碳水化合物，簡單的預(yù)處理后較易糖化，與木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)生物燃料、生物煉制相比，微藻更具競爭力。了解微藻碳水化合物的基本代謝途徑是提高增加碳水化合物生產(chǎn)率的一個先決條件，然后再通過操縱代謝途徑的主要因素進行優(yōu)化，如光照、氮源缺乏、溫度和二氧化碳等。此外，為提高微藻生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料的效率，需要更經(jīng)濟、有效的糖化和發(fā)酵技術(shù)。為了滿足生物燃料市場的需求，應(yīng)當(dāng)設(shè)計與開發(fā)能大規(guī)模培養(yǎng)碳水化合物含量高的微藻的光生物反應(yīng)器。對基于微藻生物燃料生產(chǎn)系統(tǒng)的經(jīng)濟可行性和生命周期應(yīng)進行評估，而基于微藻碳水化合物轉(zhuǎn)換成各種生物燃料產(chǎn)品的商業(yè)可行性同樣需要進行系統(tǒng)評價。

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Research progress of microalgae-based carbohydrates for biofuel production

ZHAO Yongteng，LI Tao，XU Junwei，ZHAO Peng，YU Xuya
（Faculty of Life Science and Biotechnology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，Yunnan，China）

Environmental pollution and the utilization of unrenewable fossil energy source encourage people to explore new energy source. Recently，more attentions have been paid to microalgae-based carbohydrates for biofuel production due to the fast growth，the efficient carbon dioxide fixation and the high carbohydrate accumulating potential of microalgae. Utilization of microalgal-based carbohydrates feedstock for biofuel production has the great potential，but culture scale-up becomes development bottleneck. In this paper，the composition and metabolism of microalgal-based carbohydrates are summarized. The methods of the pretreatment of microalgal-based carbohydrates are introduced，such as hydrolyzation，chemical，ultrasound and so on. In addition，the characteristics of enzymatic and chemical saccharification are comparatively analyzed. Recycling advantages of traditional anaerobic digestions and activated sludge fermentation methods with microalgae carbohydrates for biofuel production are resumed. Moreover，research progress in microalgal-based carbohydrates in producing liquid，gaseous biofuels，economy and industrialization foregrounds are reviewed. Finally，the paper makes a primary summary that more economical，efficient saccharification and fermentation technology shall be the future focus of research and development in microalgal-based carbohydrates for biofuel production.

TK 09

A

1000-6613（2014）04-0878-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.04.015

2013-10-28；修改稿日期：2013-11-26。

國家自然科學(xué)基金（21266013）及云南省自然科學(xué)基金（2010CD028）項目。

趙永騰（1989—），男，碩士研究生。E-mail 18314485014@ 139.com。聯(lián)系人：余旭亞，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事生物質(zhì)能研究。E-mail yuxuya@gmail.com。