紅豆樹異黃酮類成分抑制番茄灰霉病菌的活性研究

潘鎮(zhèn)澤，傅佳蕊，鄭 威，耿帥麗，張琳婧，徐會有，倪 林,2

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福建 福州 350002；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】番茄灰霉病主要由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染所致，是一種普遍性的真菌病害[1]，可引起爛苗、爛果等，造成番茄產(chǎn)量減少20%～40%，嚴重影響產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。目前該病害防治以化學(xué)農(nóng)藥為主，引發(fā)的殘留超標、耐藥性及環(huán)境污染等問題日益突出[3]。尋找合適的植物源抑菌劑、減少環(huán)境污染、確保食品安全成為當前亟需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題[4]。【前人研究進展】紅豆樹（Ormosia hosiei）隸屬于豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionoidee）紅豆屬（Ormosia），常綠或半落葉喬木，又名鄂西紅豆、顧山紅豆等，植物資源豐富[5]。紅豆樹富含黃酮、生物堿、木脂素等成分[6]。本課題組首次發(fā)現(xiàn)紅豆樹提取物對番茄灰霉病菌具有良好的抑制作用，經(jīng)系統(tǒng)的分離、純化和鑒定，獲得異黃酮20種[7-9]?！颈狙芯壳腥朦c】異黃酮類化合物抑菌研究多集中在醫(yī)藥或食品領(lǐng)域，關(guān)于對異黃酮類化合物植物病原真菌抑制作用和構(gòu)效關(guān)系少有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用生長速率法[10]對紅豆樹異黃酮化合物的抑菌活性進行篩選，并對抑菌活性較好、含量較高的代表性異黃酮鷹嘴豆芽素A的作用機制進行初探，以期為植物源抑菌劑的開發(fā)和紅豆樹提取物利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試植物與供試病原菌 紅豆樹（Ormosia hosieiHemsl.& E.H.Wilson）于2017年4月采自福建省福州市晉安區(qū)，供試部位為枝條。實驗室分離的異黃酮類化合物如表1、圖1所示。

表1 紅豆樹異黃酮單體化合物Table 1 Isoflavone monomer of O.hosiei

番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)藥學(xué)教育部重點實驗室提供，菌種保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院農(nóng)藥與制藥工程系樣品室。

1.1.2 試驗器材 SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），PRX-250B智能人工氣候箱（寧波賽福實驗儀器有限公司），DGL-50B立式高壓滅菌鍋（江蘇登冠醫(yī)療器械有限公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州越新儀器制造有限公司），IKARV8V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA集團），移液槍（蘇昌艾儀器公司）KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市慶泰科技有限公司）。

1.1.3 試驗試劑 工業(yè)酒精（福州艾市佳科技有限公司）；甲醇、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；馬鈴薯、離體番茄（市售）；葡萄糖、瓊脂粉（上海神尚科技公司）；純水、超純水（實驗室自制）。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅豆樹提取物及異黃酮單體化合物抑菌活性的測定 采用菌絲生長速率法測定抑菌活性。紅豆樹提取物含量為2.0 mg·mL-1，20種單體異黃酮純化合物終濃度為75 μg·mL-1，配置含藥PDA培養(yǎng)基，以同樣溶解條件的溶液作為空白對照。用打孔器（孔徑0.5 cm）打取菌絲外圈生長合適的菌餅，每個處理組設(shè)置3個重復(fù)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。菌絲生長抑制率按如下公式計算。

式中，D1為對照菌落直徑，D2為處理菌落直徑。

1.2.2 鷹嘴豆芽素A對植物病原真菌毒力測定 將鷹嘴豆芽素A配制成最終質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400 μg·mL-1的含藥 PDA 培養(yǎng)基。將市售藥丁子香酚（0.3%）作為陽性對照，設(shè)置成相同濃度的對照組，按照1.2方法評價測定抑制真菌活性，計算毒力回歸方程、有效中濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.2.3 鷹嘴豆芽素A對菌絲形態(tài)影響的觀察 在無菌條件下，用接菌針分別取處理組和對照組培養(yǎng)皿邊緣菌絲，放置于載玻片中央，加入適量乳酸酚棉藍染色液進行染色，蓋上蓋玻片，在生物顯微鏡物鏡（100×1.25，涂有香柏油）條件下觀察菌絲形態(tài)。

1.2.4 鷹嘴豆芽素A對菌絲干重的影響 將鷹嘴豆芽素A分別配制成最終質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400 μg·mL-1的PD培養(yǎng)基，使用生長合適的番茄灰霉病菌菌株，取5個菌餅接入培養(yǎng)基中，設(shè)置不加藥的PD培養(yǎng)基作為空白對照。將培養(yǎng)基置于振蕩培養(yǎng)箱中（28 ℃，110 r·min-1）培養(yǎng) 6 d，然后把培養(yǎng)后的菌絲干燥、稱重。

1.2.5 鷹嘴豆芽素A對菌絲生理生化指標的測定

（1）菌絲體提取物的制備。用打孔器（孔徑0.5 cm）打取5個生長狀態(tài)合適的番茄灰霉病菌菌餅，接入PD培養(yǎng)液中，置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，收集菌絲，用滅菌超純水沖洗2遍，并抽濾干燥。配制鷹嘴豆芽素A為100 μg·mL-1，取藥液25 mL，加入1 g病菌菌絲，設(shè)置不加藥的蒸餾水作為空白對照。28 ℃條件下，分別收集1、6、12、18、24 h后的菌絲。取各個時間段收集得到的0.4 g菌絲，加入2 mL Tris-HCl緩沖液研磨，1 000 r·min-1離心 10 min，取菌絲提取液的上清液備用。

（2）通過硫代巴比妥酸法[11]測定番茄灰霉病菌的丙二醛含量。取菌絲提取液的上清液加入2 mL 0.5 %TBA溶液反應(yīng)，沸水浴加熱10 min，取出待溶液冷卻后10 000 r·min-1離心10 min。設(shè)置0.5 %TBA溶液為空白對照，分別測定450、532、600 nm處的吸光度值，計算丙二醛含量。通過硫代巴比妥酸法[11]測定番茄灰霉病菌的丙二醛含量。取菌絲提取液的上清液加入2 mL0.5 %TBA溶液反應(yīng)，沸水浴加熱10 min，取出待溶液冷卻后10 000 r·min-1離心10 min。設(shè)置0.5 %TBA溶液為空白對照，分別測定450、532、600 nm處的吸光度值，計算丙二醛含量。

（3）鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌還原糖含量的影響。通過DNS法[12]（3.5-二硝基水楊酸法）測定還原糖的含量，取0.1 mL不同時間處理鷹嘴豆芽素A處理的菌絲提取液的上清液加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸，充分混合后，沸水浴加熱5 min，取出待溶液冷卻后加入1 mL Tris-HCl緩沖液，設(shè)置不加藥的蒸餾水作為空白對照。分別測定波長540 nm下吸光度值，計算葡萄糖含量。

（4）鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌保護酶活性影響的測定。通過紫外分光光度法[13]測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）的活性。取1 mL不同時間處理鷹嘴豆芽素A處理的菌絲提取液，加入5%硫酸鈦和濃氨水充分反應(yīng)，3 000 r·min-1離心10 min，最后加入5%硫酸5 mL至沉淀完全溶解。設(shè)置蒸餾水為空白對照，分別測定各處理在240 nm處的吸光度值。

通過愈創(chuàng)木酚比色法[13]測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）的活性。取100 μL不同時間處理鷹嘴豆芽素A處理的菌絲提取液，分別加入3 mL 0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH5.5）、1 mL 的 H2O2（1%）、1 mL 0.05 mol·L-1的愈創(chuàng)木酚溶液，37 ℃ 下水浴加熱充分混合反應(yīng).設(shè)置蒸餾水為空白對照，分別測定各處理在470 nm處的吸光度值。

通過氮藍四唑（NBT）法[14]測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性。取1 mL不同時間處理鷹嘴豆芽素A處理的菌絲提取液，反應(yīng)總體積為3 mL，依次加入50 mmol·L-1緩沖液、13 mmol·L-1甲硫氨酸（pH 7.8）、100 nmol·L-1EDTA 溶液、75 μmol·L-1NBT 溶液、2 μmol·L-1核黃素溶液充分混勻，設(shè)置蒸餾水為空白對照，分別測定各處理在560 nm處的吸光度值。

1.2.6 鷹嘴豆芽素A在離體番茄上防治效果 配制0.5、1.0和2.0 mg·mL-1的鷹嘴豆芽素A溶液。選取條件相似的番茄果實75%酒精消毒后用無菌水沖洗干凈并用滅菌濾紙擦干。用手術(shù)刀在果實上劃十字形傷口（傷口直徑1.0 cm，深度0.1 cm），放入底部鋪好濕濾紙的托盤。用0.5 cm打孔器取生長良好的番茄灰霉病菌菌餅，用接種針將帶菌餅的菌絲面接在果實十字傷口的中央， 24 h后噴施0.5、1.0和2.0 mg·mL-1的藥劑溶液及無菌水，置于25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)。

將處理好的果實培養(yǎng)10 d左右，在番茄病斑處垂直方向測量每個病斑的直徑，使用以下公式計算鷹嘴豆芽素A的相對防治效果：

式中，S1為對照病斑面積，S2為處理病斑面積。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理和分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0及Origin 9.1等軟件進行分析處理，采用方差分析（AVOVA）分析個體處理之間的差異。經(jīng)方差分析（AVOVA）確定，不同小寫字母表示在0.05 水平差異顯著。所有值均表示為3個重復(fù)的平均值+標準差（SD）

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆樹提取物及異黃酮類化合物的抑菌活性

紅豆樹提取物質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1時，抑菌率為67.25%。紅豆樹異黃酮單體化合物，在單體化合物質(zhì)量濃度75 μg·mL-1時，其中鷹嘴豆芽素A和異櫻黃素對番茄灰霉菌抑菌率相對較好，分別為46.74%和42.14%；澳白檀苷和4＇-甲氧基異黃酮-7-O-β-D-芹糖-（1→6）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等糖苷類異黃酮化合物抑菌率較低甚至無抑菌作用（表2）。

表2 紅豆樹提取物及單體化合物對番茄灰霉病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of O.hosiei extract and monomer against B.cinerea

鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌的毒力如圖2所示，EC50值為 203.189 μg·mL-1（表3）與陽性對照藥丁子香酚（EC50=175.739 μg·mL-1）相當。

表3 兩種化合物對番茄灰霉病菌的毒力測定Table 3 Toxicity of two compounds on B.cinerea

2.2 鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌菌絲形態(tài)的影響

通過顯微鏡觀察番茄灰霉病菌絲，對照組菌絲表面光滑，透明飽滿，大小均一，無斷裂現(xiàn)象。處理組菌絲有明顯的空泡化現(xiàn)象，相比于對照組透明度增加，排列雜亂，有內(nèi)容物溢出現(xiàn)象。表明鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌存在明顯毒害作用（圖2）。

2.3 鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌菌絲干重的影響

處理6 d后，加入鷹嘴豆芽素A質(zhì)量濃度為25 μg·mL-1時，菌絲干重的變化較為明顯，相比于對照組菌絲干重明顯下降；化合物濃度逐漸升高，菌絲干重逐漸降低；當鷹嘴豆芽素A質(zhì)量濃度達到最大值400 μg·mL-1時，菌絲干重僅為對照組的57.01%，與對照組的菌絲干重差異顯著，抑制率為42.99%（圖3）。

2.4 鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌細胞膜的影響

番茄灰霉病菌細胞膜受損害后引起膜脂過氧化反應(yīng)，丙二醛（MDA）就是其產(chǎn)物之一，其可以間接反映細胞膜受損程度。在鷹嘴豆芽素A質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的條件下，細胞膜MDA含量隨著處理時間的增加而不斷升高，在18 h達到峰值（309.6 nmol·g-1），隨后含量略有降低（圖4）。處理組6～24 h細胞膜MDA含量均高于對照組且差異顯著。表明鷹嘴豆芽素A可破壞菌體細胞膜，引起膜脂過氧化反應(yīng)。

2.5 鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌還原糖含量的影響

使用鷹嘴豆芽素A處理番茄灰霉病菌后，處理前1 h，番茄灰霉病菌體內(nèi)還原糖含量與對照組還原糖含量變化不大，6 h時，體內(nèi)還原糖含量高于空白對照組，說明處理組菌絲受到外源刺激導(dǎo)致自身代謝糖物質(zhì)以供生長需求；處理時間6～12 h時，處理組菌體內(nèi)還原糖含量明顯降低并低于對照組；12～24 h時處理組菌體內(nèi)還原糖含量逐漸降低且趨于平穩(wěn)，表明鷹嘴豆芽素A能夠破壞細胞膜，使?jié)B透性發(fā)生變化，導(dǎo)致胞內(nèi)還原糖泄漏，隨著處理時間延長，菌絲體胞內(nèi)還原糖含量逐漸下降 (圖5) 。

2.6 鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌CAT、POD、SOD活性的影響

圖6顯示，CAT活性在處理1 h內(nèi)無明顯變化；6 h后CAT活性迅速升高并在18 h時達到峰值，約為對照組的1.16倍；18～24 h該酶活性顯著下降，并且低于對照組。而對照組CAT活性沒有明顯變化。圖7顯示，POD活性處理1 h內(nèi)POD活性略低于對照組；1～6 h POD活性迅速升高并達到峰值，約為對照組的1.51倍；6 h后，POD活性顯著下降。圖8顯示，處理1 h內(nèi)SOD活性與對照組相比明顯升高；1～12 h SOD高于對照組；12～18 h SOD活性急劇下降，至18～24 h SOD活性緩慢降低。表明番茄灰霉病菌經(jīng)過鷹嘴豆芽素A處理后，菌絲體可以通過調(diào)節(jié)多種酶活性來減輕化合物對自身的毒害作用。

2.7 鷹嘴豆芽素A對番茄灰霉病菌在離體番茄上生長情況的影響

由表4可知，鷹嘴豆芽素A在離體番茄果實上對番茄灰霉病菌的防治效果較好，展現(xiàn)了對番茄灰霉病的預(yù)防以及治療作用。藥劑質(zhì)量濃度為0.5、1.0和2.0 mg·mL-1時處理接菌后的番茄與對照組（病斑2.56 cm2）相比，明顯抑制了菌絲生長，減小病斑的面積（1.90、0.51和0.21 cm2），且病斑直徑隨著藥劑濃度的升高總體呈現(xiàn)減小趨勢（圖9）。而在先噴藥后接菌的處理中，表現(xiàn)出相同的結(jié)果，尤其是藥劑質(zhì)量濃度為1.0和2.0 mg·mL-1時，預(yù)防效果明顯（圖10）。表明鷹嘴豆芽素A在離體番茄果實上對番茄灰霉病菌的具有良好的防治效果。

表4 鷹嘴豆芽素A在離體番茄果實上對番茄灰霉病菌的防治效果Table 4 Control efficacy of biochanin A against B.cinerea on tomatoes

3 討論

本研究對紅豆樹種子乙酸乙酯提取物中分離的化合物進行抑菌活性篩選，將番茄灰霉病菌作為供試菌，用菌絲生長速率法對單體進行初篩，結(jié)果表明：在75 μg·mL-1質(zhì)量濃度下，鷹嘴豆芽素A和異櫻黃素的抑菌率高達42.14%和46.74%，抑制的毒力效果的EC50分別為 232.6 μg·mL-1和 203.2 μg·mL-1，略低于陽性對照丁子香酚（175.7 μg·mL-1）。提示含甲氧基的非苷類異黃酮成分是乙酸乙酯活性部位的主要抑菌成分。選取抑菌效果較好的鷹嘴豆芽素A作為代表性供試化合物，探索其對植物病原真菌生理生化的指標的影響，測定處理后的菌絲體干重、菌絲形態(tài)、電導(dǎo)率、MDA、還原糖及酶活性的變化，結(jié)果顯示，其干重隨藥劑濃度增加而降低；處理后的菌絲生長受阻、形態(tài)受損、細胞內(nèi)容物泄露；番茄灰霉病菌膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，細胞膜滲透性發(fā)生改變，導(dǎo)致細胞質(zhì)滲漏，菌絲體相對電導(dǎo)率增加，細胞膜MDA含量增加，還原糖含量先增后減；菌絲體細胞內(nèi)CAT、POD和SOD酶的活性受到了干擾。此外，在離體番茄試驗中，鷹嘴豆芽素A展現(xiàn)了對番茄灰霉病的預(yù)防以及治療作用，且隨著藥劑濃度的增加，防治效果越好。

上述結(jié)果表明，異黃酮是乙酸乙酯活性部位發(fā)揮抑菌作用的主要成分，而異黃酮發(fā)揮抑菌作用的方式與其干擾菌絲體生長、損傷細胞膜功能以及降低胞內(nèi)保護酶活性等有關(guān)。

黃酮類化合物是多酚類植物中廣泛存在的代表性天然產(chǎn)物，其抑菌活性較強的特點吸引了眾多天然產(chǎn)物農(nóng)藥學(xué)者的關(guān)注。相關(guān)文獻報道，黃酮類和生物堿類化合物是豆科植物中的主要農(nóng)藥用活性成分，其中黃酮類化合物中的異黃酮多作為植保素，具有較好的抗菌活性[15]。本文從紅豆樹種子中分離的鷹嘴豆芽素A作為異黃酮類成分的一員，對番茄灰霉病菌表現(xiàn)出較好的預(yù)防和抑菌作用。前人研究表明，黃酮A環(huán)C-5、7位的羥基是重要的活性基團[16]，鷹嘴豆芽素A剛好具備這一特征，表現(xiàn)出優(yōu)于其他黃酮的抑菌活性；此外，C環(huán)C-4＇位的羥基被甲氧基取代，或許對其抑菌活性有利。