郭文逸 孫慶惠 宋麗娜 高松松 楊洪江

（天津科技大學生物工程學院 工業(yè)微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

地衣芽孢桿菌高產2，3-丁二醇菌株的選育和發(fā)酵研究

郭文逸 孫慶惠 宋麗娜 高松松 楊洪江

（天津科技大學生物工程學院 工業(yè)微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

目前2，3-丁二醇生產菌株大部分為致病菌，對人類健康和環(huán)境具有一定威脅。從牛奶樣品中分離到1株產2，3-丁二醇的芽孢桿菌127-7，分析其16S rRNA基因序列，確定該菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。進一步對菌株127-7進行紫外誘變，篩選耐受高濃度葡萄糖和高產乙偶姻的菌株。搖瓶發(fā)酵結果顯示，突變株BL41的2，3-丁二醇產量較出發(fā)菌株127-7提高了41.1%。對發(fā)酵副產物分析發(fā)現(xiàn)，不控制發(fā)酵液pH可以顯著降低乳酸產量，2，3-丁二醇產量在72 h達到81.4 g/L。進一步調整補糖策略，維持最低殘?zhí)菨舛葹?0 g/L，菌株BL41產2，3-丁二醇83.4 g/L，最高產率為1.9 g/L·h，發(fā)酵時間縮短至46 h。結果表明，地衣芽胞桿菌BL41可以作為候選菌株，用于工業(yè)規(guī)模2，3-丁二醇的生產。

地衣芽孢桿菌 2，3-丁二醇 紫外誘變 耐受葡萄糖

2，3-丁二醇是一 種重要的化工原料，廣泛用于食品、化妝品、藥物、塑料、衛(wèi)生保健和能源等領域［1］。2，3-丁二醇脫水形成的甲乙酮是有效的燃料添加劑，并且其自身具有極高的燃燒值（27 198 J/g），優(yōu)于甲醇（22 081 J/g）和乙醇（29 005 J/g），因此有望成為新能源的替代品［2，3］，但其化學合成工藝繁瑣、污染嚴重，不符合綠色化工和低碳環(huán)保的要求。微生物法生產2，3-丁二醇是一種新型工業(yè)發(fā)展模式，對緩解我國目前的資源、能源及環(huán)境危機具有重要作用［4，5］。

目前，常見的生產2，3-丁二醇的菌種為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca），產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens），陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens），多粘類芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）等［3］。其中以產酸克雷伯氏菌的研究較多，然而其為致病菌，對環(huán)境安全構成一定威脅［5］。

本研究首先分離產2，3-丁二醇的芽孢桿菌，然后進行紫外誘變，篩選到一株高產2，3-丁二醇的突變株，并進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，旨在進一步提高微生物法生產2，3-丁二醇的水平，篩選到更適于工業(yè)化生產的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，氯化鈉10，pH7.0。肌酸篩選培養(yǎng)基（g/L）：底層包括葡萄糖 10，蛋白胨 10，玉米漿 5，硫酸錳 0.05，丙酮酸鈉 5，氯化鈉 5，瓊脂20；上層培養(yǎng)基在底層培養(yǎng)基的基礎上補加0.5%（W/V）的肌酸3 mL和7.5%（W/V）的甲萘酚3 mL，肌酸和甲萘酚在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃左右時加入，用于篩選產乙偶姻菌株。葡萄糖篩選培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，氯化鈉10，瓊脂1.5，葡萄糖分別為170、180、190、200、210、220、230、240和250，pH7.0，用于篩選耐高糖菌株。MR-VP培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨7，葡萄糖5，磷酸氫二鉀5，pH7.0，用于紫外誘變后，篩選高產乙偶姻菌株。種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖40，酵母粉10，硫酸銨1，K2HPO41，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖100，酵母粉5，蛋白胨12，MnSO40.025，K2HPO43，硫酸鎂0.2，乙酸鈉5，pH7.0。除特殊說明，所有培養(yǎng)均在37℃條件下進行。

1.2 方法

1.2.1 產2，3-丁二醇芽孢桿菌的篩選 將牛奶樣品80℃保溫20 min，系列稀釋后涂布在LB平板上，分離芽孢桿菌。將分離的單菌落點接在肌酸篩選平板的下層培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后，倒入上層培養(yǎng)基，約30 min后觀察菌落顏色［6，7］。用接種針小心剝去上層培養(yǎng)基，挑選紅色較深的菌落［8］，發(fā)酵培養(yǎng)72 h，利用氣相色譜法，分析上清液中2，3-丁二醇含量。

1.2.2 分離菌株的分子鑒定 提取菌株基因組DNA［9］，以此作為模板，利用通用引物27F和1492R，擴增分離菌株的16S rRNA 基因片段［10］。PCR產物經純化后進行序列測定，將所得DNA序列通過BLAST 檢索，在GenBank的已知序列中進行同源性分析，確定與分離菌株同源程度最高的序列。

1.2.3 紫外誘變篩選高產2，3-丁二醇菌株 過夜培養(yǎng)分離菌株，菌液稀釋后分別涂布在葡萄糖濃度為0-250 g/L的LB平板上，各濃度3個平行，確定分離菌株葡萄糖耐受濃度。將分離菌株進行紫外誘變，誘變后菌液稀釋涂布于葡萄糖篩選平板上，黑布包裹培養(yǎng)24 h。選取直徑較大的菌株接種到MR-VP培養(yǎng)基中，分別取18 h和36 h的發(fā)酵液，通過肌酸比色法計算乙偶姻產量［11］。篩選乙偶姻產量高的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，利用氣相色譜法測定48 h和72 h發(fā)酵液中2，3-丁二醇產量，篩選2，3-丁二醇高產菌株。

1.2.4 pH對2，3-丁二醇產量的影響 調節(jié)培養(yǎng)基酸堿度，分析發(fā)酵液pH與乳酸產量的關系。根據酸堿度，將培養(yǎng)基分為3組：第1組發(fā)酵液初始pH值為7.0，發(fā)酵過程中不控制pH值；第2組發(fā)酵液pH值維持在6.0；第3組發(fā)酵液pH值維持在7.0，發(fā)酵過程中每隔3 h，利用鹽酸或氫氧化鈉，調節(jié)發(fā)酵液的pH不變。試驗在搖瓶中進行，兩級種子培養(yǎng)后，轉接于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min培養(yǎng)30 h。

根據上述試驗結果，在5 L發(fā)酵罐中進行分批補料發(fā)酵，裝液量為3 L，接種量為5%，通氣量為2 vvm。高攪拌轉速利于細胞的生長，然而2，3-丁二醇發(fā)酵是微好氧過程，不利于2，3-丁二醇的積累［12］，因此采用兩步攪拌轉速法，前期為400 r/min，14 h后降低轉速，為200 r/min［13］。通過補加一定量的葡萄糖，使殘?zhí)菨舛染S持在15 g/L左右。

1.2.5 殘?zhí)菨舛葘?，3-丁二醇發(fā)酵的影響 底物濃度對發(fā)酵過程具有顯著影響，提高發(fā)酵液中殘?zhí)撬?，維持葡萄糖濃度為20-30 g/L時，可能有利于生成2，3-丁二醇［14］。為了確認這一猜測，在5 L發(fā)酵罐上進行分批補料發(fā)酵，其它條件不變，殘?zhí)菨舛染S持在30 g/L，分析2，3-丁二醇發(fā)酵水平的變化。

1.2.6 分析檢測方法 使用紫外分光光度計測定OD600。將發(fā)酵液過濾后稀釋100倍，采用生物傳感分析儀SBA-40C測定葡萄糖、乳酸濃度。采用Aglient 7890A氣相色譜儀檢測2，3-丁二醇濃度，其中柱子型號：HP-INNOWax1909IN-213，色譜條件：起始柱溫95℃保留2 min；然后以6℃/min升到150℃，保留0 min；最后100℃/min升到220℃，保留2 min；氮氣、氫氣和空氣流速分別是2、30和300 mL/min。進樣口和氫氣火焰檢測器的溫度是260℃。

2 結果

2.1 產2,3-丁二醇的菌株篩選及鑒定

將LB平板上形成的菌落點接在肌酸平板上進行分析，12個菌落紅色較深。將其發(fā)酵48 h，測量2，3-BD產量。結果（表1）顯示，菌株127-7產2，3-丁二醇水平較高，為48.2 g/L。利用PCR方法擴增該菌株16S rRNA基因，測序后利用NCBI網站的BLAST軟件進行比對，發(fā)現(xiàn)菌株127-7與多株B. licheniformis菌株高度同源，達到99%-100%，因此確定菌株127-7為地衣芽胞桿菌。將16S rRNA序列上傳至GenBank，獲得序列號為KF935264。

2.2 紫外誘變篩選高產2,3-丁二醇菌株

出發(fā)菌株127-7在葡萄糖濃度為250 g/L的LB平板上無菌落長出，此濃度作為篩選葡萄糖耐受菌株的條件。繪制菌株127-7的紫外致死曲線，紫外誘變時間為30 s，致死率達到87.1%。采用該條件，對菌株127-7進行誘變，涂布在含有250 g/L葡萄糖的篩選平板上，共得到2 406株突變子。

挑選菌落直徑較大（＞1.5 mm）的突變子105株，進行肌酸比色試驗，分別取發(fā)酵18 h和36 h的發(fā)酵液進行測定，分析乙偶姻含量。選取10株乙偶姻含量高的菌株，進一步分析2，3-丁二醇的產量。48 h發(fā)酵結果（圖1）顯示，突變子BL41、BL18、BL16、BL37、BL35和BL21，它們2，3-丁二醇產量均高于出發(fā)菌株127-7，占所挑選菌株的60.0%。其中，BL41的2，3-丁二醇產量比出發(fā)菌株高41.1%，轉化率達到理論值的60.5%。

2.3 pH對2,3-丁二醇產量的影響

乳酸是2，3-丁二醇發(fā)酵過程中主要的副產物，為了分析培養(yǎng)基酸堿度與菌株BL41產乳酸水平的關系，進行了搖瓶試驗。結果（表2）顯示，將發(fā)酵過程pH始終控制在7.0 時，生成大量乳酸（21.0 g/L）；pH始終在6.0時，乳酸產量則顯著減少，30 h后僅為0 g/L；培養(yǎng)基初始pH為7.0，發(fā)酵過程中不控制酸堿度，隨著發(fā)酵的進行，pH不斷下降，乳酸產量最終也為0 g/L。

所以在分批補料發(fā)酵中，選擇發(fā)酵液初始pH值為7.0，發(fā)酵過程中不控制酸堿度這一條件。結果（圖2）顯示，72 h僅得到3 g/L的乳酸，2，3-丁二醇的產量則達到81.4 g/L。

2.4 殘?zhí)菨舛葘?,3-丁二醇產量的影響

葡萄糖濃度對2，3-丁二醇發(fā)酵具有一定的影響。圖2顯示，在葡萄糖濃度為30 g/L時2，3-丁二醇產率最高，為1.9 g/L·h，而隨著葡萄糖濃度降低，產率也隨之下降，推測發(fā)酵液中較低的葡萄糖濃度導致葡萄糖利用緩慢，產率下降，周期延長。為了驗證這一假設，我們在分批補料發(fā)酵中，將殘?zhí)菨舛染S持在30 g/L。結果（圖3）顯示，2，3-丁二醇產量在46 h時即達到最高，為83.4 g/L，產率在22 h后一直維持在1.9 g/L·h左右，發(fā)酵時間明顯縮短。發(fā)酵過程中，只有很低水平的乳酸產生。因此持續(xù)的高水平產率導致發(fā)酵時間變短。

3 討論

地衣芽孢桿菌是常見的2，3-丁二醇生產菌株，它被美國食品藥品監(jiān)督管理局（US Food and Drug Administration）認定為GRAS（generally recognized as safe）菌株，由于其不具有致病性，可以安全的用于大規(guī)模工業(yè)生產［13］。此外，地衣芽孢桿菌具有產生淀粉酶和木聚糖酶的能力，可以利用農業(yè)廢棄物為原料發(fā)酵生產2，3-丁二醇，不僅可以降低生產成本，而且不與人類爭奪資源［16］。但從目前報道來看，其生產能力普遍低于2，3-丁二醇生產優(yōu)勢菌克雷伯氏菌和粘質沙雷氏菌［17］。因此，努力提高芽孢桿菌生產2，3-丁二醇產量具有重要意義。

近年來，對2，3-丁二醇發(fā)酵菌種的選育，主要圍繞著菌種的誘變篩選和基因工程的改造等［18］。本研究使用紫外誘變育種，是菌種選育研究中最常采用的方法，該方法操作簡便，并且安全［19］。有研究表明提高菌株的耐糖性不僅可以提高2，3-丁二醇產量，還可以縮短發(fā)酵時間［20］。所以紫外誘變后，首先進行耐高糖菌株的篩選。乙偶姻是2，3-丁二醇的前體物質，通過篩選乙偶姻高產菌株，進而得到2，3-丁二醇高產菌株，而采用肌酸比色法分離篩選高產乙偶姻的菌株，大大減少了篩選的工作量。由此獲得突變株BL41，通過搖瓶試驗，2，3-丁二醇產量較出發(fā)菌株127-7提高了41.1%。

發(fā)酵過程中pH是代謝活動的綜合指標，是發(fā)酵過程中重要控制參數［21］，在混和酸發(fā)酵過程中，pH對發(fā)酵產物組成的影響尤其顯著，直接影響碳源的代謝流向。堿性條件下，發(fā)酵有利于有機酸的形成，從而導致2，3-丁二醇合成量的減少。而酸性條件下，2，3-丁二醇的合成量較堿性條件下有明顯上升，有機酸量則明顯下降［22］。不同研究中，對培養(yǎng)基及發(fā)酵過程中的pH值采取了不同控制策略，可能會對2,3-丁二醇的產量產生影響［13，14］。而乳酸在pH為7.0-8.0是主要產物，在pH5.0-6.5時，2,3-丁二醇是主要的產物［1］。本研究中，控制pH為7.0時產生大量乳酸，而在pH為6.0和自然pH條件下，乳酸產量則顯著減少。在分批補料發(fā)酵條件下，發(fā)酵過程中不控制pH，副產物乳酸的產量很低，碳源更多地流向2，3-丁二醇途徑，產量達到81.4 g/L，顯著地提高了2，3-丁二醇的生產效率。

采用不同的補料方式，對2，3-丁二醇的產量會產生不同的影響。針對菌株粘質沙雷氏菌H30的研究發(fā)現(xiàn)，采用恒底物濃度發(fā)酵方式，高殘?zhí)菨舛龋?5-25 g/L）2，3-丁二醇的產量，高于低殘?zhí)菨舛龋? g/L）［23］。以肺炎克雷伯氏菌SDM為生產菌株，發(fā)現(xiàn)與脈沖補料、恒速補料和指數補料相比，將葡萄糖濃度控制在20-30 g/L的恒底物濃度補料策略最為有效［15］。而地衣芽孢桿菌10-1-A，能夠耐受高濃度葡萄糖，在殘?zhí)菨舛葹?0-70 g/L之間時，能夠維持2，3-丁二醇的較高產率［13］。本研究也發(fā)現(xiàn)，在分批補料發(fā)酵中，將殘?zhí)菨舛染S持在30 g/L時，可以長時間維持2，3-丁二醇較高的產率，使發(fā)酵時間縮短了26 h，提高了生產效率。

4 結論

本研究從牛奶中分離到1株地衣芽孢桿菌，經紫外誘變后，突變子BL41合成2，3-丁二醇的能力顯著提高。進一步在5 L發(fā)酵罐中進行工藝優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)不控制酸堿度，可以明顯減少乳酸的水平，碳源更多的流向2，3-丁二醇合成途徑。另外，提高殘?zhí)菨舛戎?0 g/L，2，3-丁二醇產量幾乎不變，但發(fā)酵時間縮短26 h。結果顯示，地衣芽胞桿菌BL41可以作為候選菌株，用于大規(guī)模生產2，3-丁二醇。

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（責任編輯 馬鑫）

Breeding and Fermentation Characterization of Mutants of Bacillus licheniformis for 2，3-Butanediol Production

Guo Wenyi Sun Qinghui Song Lina Gao Songsong Yang Hongjiang
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

Currently, most isolated 2,3-butanediol producing strains are pathogens and they cause certain risks to public health and environments. In this work,Bacillussp. 127-7 was isolated for 2,3-butanediol（BD）production from raw milk samples. It was identified asBacillus licheniformisby analyzing its 16S rRNA gene sequence. By UV-mutagenesis, mutants that could endure high glucose concentrations and produce relatively high amounts of acetoin were isolated for further analysis. In shake-flask fermentations, 2,3-BD production was increased by 41.1% in mutant strain BL41 compared with the parent strain 127-7. Additionally, BL41 yielded much less amounts of lactate acid in the cultures without acidity control and 2,3-BD reached 81.4 g/L in the fed-batch fermentation. Moreover, the minimal residual glucose concentration was incre ased to 30 g/L in the culture, the fermentation time was significantly reduced to 46 h with 83.4 g/L 2,3-BD. The highest productivity is up to 1.9 g/L·h. The results showed thatB. licheniformisBL41 may be used as a candidate strain for industrial production of 2,3-butanediol.

Bacillus licheniformis2，3-butanediol UV-mutagenesis Glucose tolerance

2014-01-23

郭文逸，女，碩士研究生，研究方向：工業(yè)微生物育種；E-mail: guowenyi000@163.com

楊洪江，男，博士，教授，研究方向：工業(yè)微生物育種；E-mail: hongjiangyang@tust.edu.cn