梁廣勝， 殷嫦嫦， 殷 明， 鄔亞華， 李輝敏， 劉玉亮，3， 魏強(qiáng)強(qiáng)，3

（1.九江學(xué)院醫(yī)學(xué)部分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室， 江西 九江 332000； 2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科， 江西 南昌330006；3.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部， 江西 南昌 330006）

復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化的影響

梁廣勝1，2，3， 殷嫦嫦1*， 殷 明2， 鄔亞華1， 李輝敏1， 劉玉亮2，3， 魏強(qiáng)強(qiáng)2，3

（1.九江學(xué)院醫(yī)學(xué)部分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室， 江西 九江 332000； 2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科， 江西 南昌330006；3.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部， 江西 南昌 330006）

目的 研究復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的影響。方法 采用全骨髓差速貼壁法體外分離、 純化和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 取 P3代細(xì)胞， 分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組， 用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定細(xì)胞， 采用 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 顯微鏡下觀察兩組的細(xì)胞形態(tài)和組織化學(xué)染色的鈣化結(jié)節(jié)； 速率法測(cè)定堿性磷酸酶 （ALP） 活性和 RT-PCR檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中骨橋蛋白和 I型膠原的 mRNA表達(dá)來鑒定成骨作用。 結(jié)果 體外培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)表面標(biāo)志； 復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi) ALP活性增高并形成明顯鈣結(jié)節(jié)； PCR結(jié)果顯示復(fù)葉耳蕨總黃酮上調(diào)骨橋蛋白和 I型膠原的 mRNA表達(dá)。 結(jié)論 20 μg/mL復(fù)葉耳蕨總黃酮可促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨樣細(xì)胞。

復(fù)葉耳蕨總黃酮；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；增殖；堿性磷酸酶；成骨分化

江西百姓采用民間秘方復(fù)葉耳蕨治療黃疸性肝炎有長(zhǎng)久的歷史，但有不少孕婦在用該草藥治療肝炎的過程出現(xiàn)流產(chǎn)，故引起研究者的注意，進(jìn)行了系列研究。研究結(jié)果表明復(fù)葉耳蕨具有抗生育、加強(qiáng)子宮收縮等類激素作用，發(fā)揮藥理作用的主要成分是黃酮類化合物［1］。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， 復(fù)葉耳蕨總黃酮中含有眾多類黃酮、香豆素類化合物、蒽醌類和其他化合物［2］。 有研究報(bào)道， 黃酮類化合物在脂質(zhì)過氧化、 DPPH自由基清除、羥基自由基清除及 H2O2清除方面表現(xiàn)出劑量依賴性的抗氧化能力和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨分化及成骨細(xì)胞的功 能［3-4］。 因此推測(cè)， 復(fù)葉耳蕨 總黃酮可能具有較強(qiáng)的促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （BMSCs）成骨分化作用。本實(shí)驗(yàn)研究復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)大鼠BMSCs的增殖和成骨分化的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.1.1 動(dòng)物 4 周齡健康清潔級(jí) SD大鼠 5 只， 雌雄不限， 體質(zhì)量約 40 g， 購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物 有 限 公 司，合 格 許 可 證 號(hào)： HNA SLKJ20122049。

1.1.2 受試物 藥材于 2012 年 10 月采自江西廬山的秀峰，經(jīng)九江森林植物標(biāo)本館館長(zhǎng)譚策銘鑒定為刺頭復(fù) 葉 耳 蕨 Arachniodes exilis（ Hance） Ching的根莖， 標(biāo)本 （No.AEC1210）存放于九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室實(shí)驗(yàn)室。復(fù)葉耳蕨總黃酮的提取由九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系李輝敏副教授提取。 提取方法為采用超聲波輔助的 75%乙醇浸提，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將乙醇提取液濃縮，后用聚酰胺對(duì)其進(jìn)行純化；再經(jīng)過冷凍干燥得復(fù)葉耳蕨總黃酮的干燥品 （用蘆丁作對(duì)照品， 采用 HLPC法測(cè)得所提取的復(fù)葉耳蕨總黃酮含有蘆丁樣結(jié)構(gòu)的化合物為75%）。復(fù)葉耳蕨總黃酮呈粉末狀、 黃棕色至紅棕色， 木化成品［3］。 稱取 10mg復(fù)葉耳蕨總黃酮溶于100 μL的 DMSO， 取 10 μL上 述 溶 液 混 入 于9 990 μL完全培養(yǎng)基中， 配制成 100 μg/mL的復(fù)葉耳蕨總黃酮貯存液，然后再配制成不同質(zhì)量濃度的受試物即配制含藥的完全培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基用于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM/F12 （ Hyclone公司，澳大利亞）、 Fetal Bovine Serum （GIBCO公司， 美國(guó)）、 堿性磷酸酶 （ALP） ［ Assay Kit Based on IFCC （ 2007 ） ］ 、 MTT粉 （ Solarbio公 司， 中 國(guó) ）、0.25%胰蛋白酶 （含 EDTA）、 PBS 粉劑、 細(xì)胞裂解液 （北京普利萊基因技術(shù)有限公司）、 校準(zhǔn)品及質(zhì)控血清 （中生北控股份有限公司產(chǎn)品）。 6 孔培養(yǎng)板 （CORNING公司， 美國(guó)）、 TS100-F倒置相差顯微鏡 （Nikon 公司， 日本）、 超級(jí)恒溫水浴 HH-601 （常州國(guó)華電器有限公司）、L-3180 型半自動(dòng)生化分析儀 （上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）、 CO2恒溫水浴箱 （SIM公司）、 超凈臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備有限公司）、 Model680 型酶標(biāo)儀 （ BIO-RAD公司，美國(guó)）、 血球計(jì)算板 （上海求精生化試劑儀器有限公司）、 超速離心機(jī) （Sigma公司）、 二甲基亞砜（DMSO Sigma公司）、 流式細(xì)胞儀 （美國(guó) B—D公司 Ver3.0）、 茜素紅粉 （西隴化工股份有限公司）、硝酸銀 （上海三愛思試劑有限公司）、硫代硫酸鈉（天津市風(fēng)船化工試劑科技有限公司）、中性紅（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SD大鼠 BMSCs體外分離、純化及培養(yǎng)

無菌條件下獲取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨并去兩側(cè)骨骺端， 用 PBS 緩沖液反復(fù)沖洗骨髓腔， 收集骨髓細(xì)胞于離心管中， 1 000 r/min 梯度離心 5 min， 棄上清， 加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基充分吹打均勻，重復(fù)離心 1 次， 棄上清， 加入含 10%FBS的 DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀， 調(diào)整細(xì)胞密度為 1 ×106個(gè)/mL， 接種于 25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。 48 h后首次換液， 棄掉未貼壁細(xì)胞， 以后每2～3 d換液1次， 純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 細(xì)胞達(dá)80% ～90%的融合， 胰蛋白酶消化傳代。 倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及形態(tài)特征，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面的標(biāo)志物 CD44 和 CD90鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 （MTT比色法） 取生長(zhǎng)良好且融合達(dá) 80% ～90%的 P3代細(xì)胞， 常規(guī)消化 離心， 棄上清， 調(diào)整 細(xì) 胞 密 度 為 1 ×104個(gè)/mL， 按每孔 200 μL接種于 96 孔板， 設(shè)立 5 個(gè)實(shí)驗(yàn)復(fù)孔和空白對(duì)照組， 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。 每2 d更換培養(yǎng)基， 分別在第 1 天 ～第 11天共11 個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取 1 個(gè) 96 孔板行 MTT檢測(cè)：每孔加入 5%MTT溶液 20 μL孵育 4 h，然后吸棄上清液， 每孔加入二甲基亞砜 （DMSO） 150 μL，充分搖勻震蕩 10 min 待結(jié)晶物充分溶解后， 應(yīng)用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的吸光度值 （A值），記錄結(jié)果， 并繪制成大鼠 BMSCs的生長(zhǎng)曲線 （X軸-時(shí)間， Y軸-吸光度）。

1.2.3 復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì) BMSCs增殖的影響 取P3代細(xì)胞， 以 2 000 個(gè)/mL接種于 96 孔培養(yǎng)板，在37 ℃、 5%相對(duì)飽和濕度的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后吸去原培養(yǎng)基， 加入含不同質(zhì)量濃度的復(fù)葉耳蕨總黃酮培養(yǎng)基 200 μL進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組加入等量的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。 分別在 12、 24、 48、72 h 向每孔加入10 μL的 CCK液體， 孵育2 h， 用酶標(biāo)儀測(cè)定 450 nm處的吸光度并繪制成圖表。

1.2.4 復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì) BMSCs成骨分化的影響取 P3代 BMSCs消化后按 2 ×105個(gè)/mL接種至24 孔板， 24 h 后吸去原完全培養(yǎng)基，按下面分組，每?jī)山M一板進(jìn)行誘導(dǎo)分化： 對(duì)照組為每孔加 DMSO（0.1%） +DMEM/F-12 培 養(yǎng) 液； 實(shí) 驗(yàn) 組 為 含 20 μg/mL復(fù)葉耳蕨總黃酮 （0.1%DMSO） 的培養(yǎng)基。 共誘導(dǎo)7 d，每 3 d換液 1次。 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照，并用于以下檢測(cè)。

1.2.5 檢測(cè) ALP酶活性 采用 IFCC推薦的磷酸對(duì)硝基苯酚法測(cè)定 （速率法），操作步驟按說明書， 記錄檢測(cè)樣品每分鐘吸光度變化值 （ΔA/ min）， 計(jì)算樣品中堿性磷酸酶活力 （ U/L）， 并繪制成表格進(jìn)行比較。

1.2.6 鈣化結(jié)節(jié)染色 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第 7 天采用Alizarin Red S （ ARS） 染色法和 Von Kossa染色法進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)的組織化學(xué)染色， 并在 10 ×10 倍顯微鏡 下 觀 察。 Alizarin Red S 法：PBS 沖 洗 3 次，95%乙醇固定 10 min，三蒸水沖洗 3 次；加 2%茜素紅后， 置于 37 ℃孵育 30min； 三蒸水沖洗 3 次，干燥、封 片。 鈣 結(jié) 節(jié) 成 紅 色。Von Kossa染 色：PBS 沖洗 3 次， 95%乙醇固定 5 min， 三蒸水漂洗 3次， 加5%硝酸銀溶液， 紫外照射 1.5 h， 漂洗 3遍，加5%硫代硫酸鈉中和殘留硝酸銀， 漂洗 3遍， 1% 中性 紅 復(fù) 染 10 min， 漂 洗 3 遍， 干 燥，封片。

1.2.7 RT-PCR檢測(cè) 常規(guī)種板 （24 孔板）， 分 2組： 加藥組 （20 μg/mL復(fù)葉耳蕨總黃酮） 和對(duì)照組 （加等量完全培養(yǎng)基）， 每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔， 培養(yǎng)24 h 后按照康為世紀(jì) RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行操作， 以逆轉(zhuǎn)后的 cDNA為模版擴(kuò)增檢測(cè)骨橋蛋白 （OPN）和 I型膠原 （ Coll-Ⅰ）mRNA的表達(dá)，擴(kuò)增后制膠跑電泳拍照， 目標(biāo)基因 OPN、 Coll-Ⅰ、內(nèi)參 GAPDH的引物見表1。

表 1 RT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence of real time RT-PCR

1.2.8 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 分 析 所 有 數(shù)據(jù) 均 采 用 SPSS 19.0軟件的 onewayANOVA方差分析統(tǒng)計(jì)分析， 結(jié)果以平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 （）表示， 并兩兩樣本間率的比較采用 χ2檢驗(yàn)， 檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05， P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P＜0.01 為具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠 BMSCs形態(tài)學(xué)特征 第 3 天首次換液可見分散的懸浮細(xì)胞，以折光性強(qiáng)的圓形細(xì)胞為主（ 圖1A） ； 6 ～10 d 后， 貼 壁 細(xì) 胞 明顯 增 多， 出 現(xiàn)成纖維樣細(xì)胞外觀，呈長(zhǎng)梭形 （ 圖 1B和圖 1C）；14 d 左右細(xì) 胞可達(dá) 80% ～90%的融合， 細(xì) 胞 排 列具有明顯的方向性， 呈漩渦狀 （圖 1D）。 多次傳代后，細(xì)胞仍呈現(xiàn)梭形細(xì)胞群，呈漩渦狀平行生長(zhǎng)（圖1E）。

2.2 大鼠 BMSCs流式細(xì)胞儀鑒定 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示 CD44 表達(dá)陽(yáng)性， CD90 陰性， BMSCs均一性好， 純度達(dá)90%以上。 鑒定結(jié)果見圖 2。

圖 1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)觀察 （ ×100）Fig.1 Cellular m orphology observation （ ×100）

圖2 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原分子表達(dá)情況Fig.2 Surface an tigens of rat bonemarrow mesenchymal stem cells

2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定 （MTT比色法） 在酶標(biāo)儀上選擇 490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光值， 以時(shí)間 （t） 為橫軸， 吸光度 （A） 為縱軸繪制 P3代細(xì)胞生長(zhǎng)整個(gè)過程中細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化 （圖 3）。 BMSCs在接種的1～3 d內(nèi)增殖相對(duì)緩慢， 處于潛伏期。 在第4天～第9天生長(zhǎng)曲線近似成線性曲線，表明這段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，處于指數(shù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第10天以后曲線相對(duì)變緩， 細(xì)胞增殖速率減慢，處于平臺(tái)期。

圖3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.3 G row th curve of rat bonemarrow mesenchymal stem cells

2.4 復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì) BMSCs增殖的影響 與對(duì)照組比較， 20 μg/mL復(fù)葉耳蕨總黃酮 對(duì)大鼠的BMSCs增殖具有輕度促進(jìn)作用。 隨著復(fù)葉耳蕨總黃酮質(zhì)量濃度的增加，促細(xì)胞增殖活性降低，高于40 μg/m L則表現(xiàn)為明顯的抑制增殖作用且呈劑量依賴性地降低大鼠 BMSCs的增殖能力， 見圖4。

2.5 ALP活性檢測(cè) 各組成骨分化過程中 ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示： 實(shí)驗(yàn)組的第 6 天 ALP活性明顯高于第 3 天 （P＜0.05）， 而3 d 和6 d 后的實(shí)驗(yàn)組ALP活性明顯高于相應(yīng)的對(duì)照組 （P＜0.05）。 見表2。

圖4 復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of grow th curve of total flavonoids from Arachniodes exilis on rat bonemar row mesenchymal stem cells

表2 堿性磷酸酶活性測(cè)定 （， n=5）Tab.2 Determ ination of alkaline phosphatase activity

表2 堿性磷酸酶活性測(cè)定 （， n=5）Tab.2 Determ ination of alkaline phosphatase activity

注： 與對(duì)照組相比，**P＜0.01

（， n=5）組 別 吸光度 （A）3 d 6 d對(duì) 照組0.115 0 ±0.002 2 0.228 6 ±0.004 9實(shí) 驗(yàn)組 0.304 4 ±0.002 3** 0.434 4 ±0.004 0**

2.6 鈣結(jié)節(jié)染色 ARS 染色： 復(fù)葉耳蕨總黃酮誘導(dǎo)組細(xì)胞胞漿中可見橘紅色礦化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色陽(yáng)性，而對(duì)照組則為陰性。細(xì)胞聚集的地方鈣結(jié)節(jié)明顯增多。 Von Kossa染色 ： 復(fù)葉耳蕨總黃酮誘導(dǎo)組加入硝酸銀后， 在紫外線下染色 90 min 后可見黑色顆粒，光鏡下可見粗大的黑色結(jié)節(jié)，且周圍有粉紅色細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 見圖5。

2.7 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 大鼠經(jīng)誘導(dǎo) 6 d 后結(jié)果：

圖5 兩種染色法鑒定鈣結(jié)節(jié)Fig.5 Identification of two kinds of calcium nodules staining

與對(duì)照組相比， 實(shí)驗(yàn)組的 OPN和 Coll-Ⅰ轉(zhuǎn)錄水平明顯增強(qiáng) （P＜0.05 或 P＜0.01）。 說明復(fù)葉耳蕨總黃酮可以促進(jìn) BMSCs高表達(dá) OPN和 Coll-Ⅰ， 利于成骨分化進(jìn)程。 見圖6。

圖6 PCR電泳圖和 PCR灰度掃描定量結(jié)果Fig.6 PCR electrophoresis and quantitative results of PCR grayscale scanning

3 討論

BMSCs具有眾多優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是臨床上較理想的治療性細(xì)胞，如提取簡(jiǎn)單方便、來源充足、攜帶免疫調(diào)節(jié)機(jī)制和抗炎機(jī)制、避免免疫排斥反應(yīng)、高度自我 更 新 能 力 和 多 向 分 化 潛 能 等［5-6］。 特 定 的作用因素促進(jìn) BMSCs分化為成骨細(xì)胞，有助于促進(jìn)骨折愈合和骨質(zhì)疏松癥的防治［7］， 因此尋找促進(jìn) BMSCs分化為成骨細(xì)胞的物質(zhì)對(duì)于干細(xì)胞治療在臨床的應(yīng)用具有重要的意義。 獲得純化 BMSCs是干細(xì)胞治療關(guān)鍵步驟，本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法分離、 純化 BMSCs， 通過細(xì)胞形態(tài)及流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記物分析所得的 BMSCs為高度純化的細(xì)胞， 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明 BMSCs生長(zhǎng)良好，這些結(jié)果為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

黃酮類化合物對(duì)細(xì)胞作用具有雙向性，即在不同的劑量下可呈現(xiàn)促增殖或抑制增殖作用，因此選擇一個(gè)適合實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃幬飫┝渴钦T導(dǎo) BMSCs分化成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過細(xì)胞增殖生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度復(fù)葉耳蕨總黃酮促進(jìn) BMSCs的增殖，高質(zhì)量濃度復(fù)葉耳蕨總黃酮具有抑制其增殖。與對(duì)照組相比， 20 μg/mL復(fù)葉耳蕨總黃酮組的 A值在不同時(shí)間均略高于對(duì)照組，說明復(fù)葉耳蕨總黃酮能輕度促進(jìn)細(xì)胞增殖，然而復(fù)葉耳蕨總黃酮質(zhì)量濃度高于 40 μg/mL時(shí)， 能明顯抑制 BMSCs的增殖，且隨復(fù)葉耳蕨總黃酮的質(zhì)量濃度增高，其抑制作用越強(qiáng)。 增殖與分化是 BMSCs的兩個(gè)重要的生物學(xué)特性，兩者之間存在相互關(guān)聯(lián)的關(guān)系，過度增殖勢(shì)必抑制分化，但抑制細(xì)胞的增殖亦影響細(xì)胞生物學(xué)活性， 因此， 本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì) BMSCs有輕度促進(jìn)增殖作用的質(zhì)量濃度 （20 μg/mL） 復(fù)葉耳蕨總黃酮作為實(shí)驗(yàn)劑量即為實(shí)驗(yàn)組。

目前，ALP活性、 OPN和 Coll-Ⅰ的表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)的檢測(cè)是鑒定 BMSCs成功分化為成骨細(xì)胞的主要標(biāo)志［8-9］。 ALP可分解有機(jī) 質(zhì)中磷 酸， 增加局部無機(jī)磷酸鹽濃度，促進(jìn)礦化，是成骨細(xì)胞分化和功能成熟的前期標(biāo)志［10］，其活性越高， 說明前期成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞的分化越明顯。本實(shí)驗(yàn)用 20 μg/m L復(fù)葉耳蕨總黃酮干預(yù)后的第 3 天和第6 天， ALP活性明顯增大，另外， 實(shí)驗(yàn)組的 ALP活性均比對(duì)照組高，且在第3天時(shí)兩組的差異性更顯著 （P＜0.01）， 實(shí)驗(yàn)組的 ALP活性比對(duì)照組高 2倍以上， 這說明復(fù)葉耳蕨總黃酮能明顯促進(jìn) BMSCs生成 ALP或增強(qiáng) ALP的活性。 OPN和 Coll-Ⅰ是分化成熟成骨細(xì)胞分泌的特異性蛋白，可作為成骨細(xì) 胞 分 化 的 中 期 指 標(biāo)［11-12］。 RT-PCR 實(shí) 驗(yàn) 還 發(fā)現(xiàn)， 在誘導(dǎo)的第 6 天， 實(shí)驗(yàn)組的 OPN和 Coll-Ⅰ的mRNA比對(duì)照組的表達(dá)量明顯增加。 另外， 礦化結(jié)節(jié)的形成是成骨細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)中， 在誘導(dǎo)的第 7 天， 采用了 Alizarin Red S 染色和 Von Kossa染色兩種染色方法分別對(duì)兩組進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色定性鑒定，兩種染色方法顯示實(shí)驗(yàn)組礦化結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性，表明實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的細(xì)胞具有成骨功能，并且復(fù)葉耳蕨總黃酮組的礦化結(jié)節(jié)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組。以上結(jié)果表明：復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化具有明顯的促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)通過研究和探討復(fù)葉耳蕨總黃酮對(duì)大鼠BMSCs向成骨分化的影響發(fā)現(xiàn)， 復(fù)葉耳蕨總黃酮可明顯促進(jìn) BMSCs向成骨分化作用； 其作用是通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi) ALP活性、促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成、 上調(diào)骨橋蛋白和Ⅰ型膠原的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化進(jìn)程。本研究為后續(xù)進(jìn)一步研究復(fù)葉耳蕨總黃酮促成骨的機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

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Effect of total flavonoids from Arachniodes exilis on proliferation and osteogenic differentiation of rat bonemarrow mesenchymal stem cells

LIANG Guang-sheng1，2，3， YIN Chang-chang1*， YIN Ming2， WU Ya-hua1， LIHui-min1，LIU Yu-liang2，3， WEIQiang-qiang2，3
（1.Analysis and Test Laboratory of Jiujiang University， Jiujiang 332000， China； 2.First Department of Orthopedics， The Second Hospital Affiliated to Nanchang University， Nanchang 330006， China； 3.Graduate School of Medicine Nanchang University， Nanchang 330006， China）

AIM To study the effect of total flavonoids from Arachniodes exilis on proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells（ BMSCs） .METHODS Rat BMSCs， isolated from rats bonemarrow in vitro by whole bonemarrow adherentmethod，was purified and cultured.Identification of thesurface marker of BMSCs and determination of their growth curve were completed by MTT.They were divided into experimental（ total flavonoids from Arachniodes exilis） and control groups， and osteogenesis was identified bymicroscopic cellmorphology， the activity of alkaline phosphatase， the formation of calcified nodules by staining， and the expression ofosteopontin and collagen 1 were tested by RT-PCR.RESULTS Cells cultured in vitro expressed the surfacemarkers of BMSCs.The total flavonoids from Arachniodes exilis improved the activity of ALP， promoted the formation of calcium nodule， and increased the expression of osteopontin and Icollagen shown by PCR results. CONCLUSION 20 μg/mL total flavonoids from Arachnidesexilis can promote ratbonemarrowmesenchymal stem cells to differentiate into bone cells.

total flavonoids from Arachniodes exilis； bone marrow mesenchymal stem cells； proliferation；ALP； osteogenesis

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0456-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.004

2013-06-11

采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室可用的藥理研究模型系統(tǒng)研究復(fù)葉耳厥抑制 HIV-1 復(fù)制的有效成分 （81160536）

梁 廣 勝 （ 1986—） ， 男， 碩 士 生， 醫(yī) 師， 研 究 方 向： 脊 柱 和 骨 關(guān) 節(jié) 疾 病， 骨 科 疾 病。 Tel： 13698416062， E-mail： lgs-19860322@163.com

*通信作者： 殷 嫦 嫦， 女， 博 士， 碩 士 生 導(dǎo) 師， 教 授， 研 究 方 向： 生 物 化 學(xué) 與 臨 床 生 物 化 學(xué)。 Tel： 13607920508， E-mail： yinchangchang112@163.com