曹燕飛 張咩慶 陳宏達(dá) 王陳芳 杜靜靜

●論 著

I型糖尿病大鼠血漿胃動素與胃動力之間關(guān)系的研究

曹燕飛 張咩慶 陳宏達(dá) 王陳芳 杜靜靜

目的 探討I型糖尿病大鼠血漿胃動素與胃動力之間的關(guān)系。 方法 將Wistar清潔級大鼠30只采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（鏈脲佐菌素30mg/kg，腹腔注射），正常對照組（腹腔注射等量的0．9%氯化鈉溶液）。美藍(lán)灌胃實(shí)驗(yàn)測定胃排空率，ELISA法測定血漿胃動素濃度，8周后觀察胃平滑肌組織病理變化。 結(jié)果 與正常對照組比較，模型組大鼠血漿胃動素濃度明顯升高（P＜0．05），胃排空率下降（P＜0．01），光鏡下胃平滑肌組織結(jié)構(gòu)紊亂。 結(jié)論 I型糖尿病大鼠的胃動力并沒有隨血漿胃動素濃度升高而增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)了一定程度的降低，可能與大鼠胃平滑肌組織病變及胃動素抵抗有關(guān)。

糖尿病胃輕癱 胃動素 胃動力

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病常見慢性并發(fā)癥之一，是繼發(fā)于糖尿病的以胃動力低下、胃排空延遲、胃節(jié)律紊亂為特點(diǎn)的臨床綜合征。國外資料顯示，50%的糖尿病患者有消化不良癥狀，50%～76%的糖尿病患者有胃排空延遲[1]。DGP病理機(jī)制尚未完全闡明，它可能是自主神經(jīng)功能障礙、胃腸激素分泌異常、高血糖、平滑肌損害以及微血管病變等因素的綜合影響的結(jié)果[2]。本實(shí)驗(yàn)利用小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的I型糖尿病大鼠模型，探討其血漿胃動素與胃動力變化的關(guān)系，旨在進(jìn)一步闡明DGP的相關(guān)病理機(jī)制，為探索新的治療方法提供客觀實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物3月齡雄性Wistar清潔級大鼠30只，體重230～240g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 試劑及造模材料0.9%氯化鈉溶液由杭州民生藥業(yè)有限公司提供，生產(chǎn)批號：21201204；10%中性甲醛溶液由上?；瘜W(xué)試劑公司提供；STZ由美國Sigma公司提供：將STZ溶于0.1mmol/L的枸櫞酸鈉緩沖液（pH4.5）中，配制成濃度為2%的溶液。

1.3 儀器全自動生化儀器：Hitachi 7600-020Automatic analyzer，株式會社日立高新技術(shù)；離心機(jī)：Labogenscanspeed 1248R，丹麥Labogene公司；顯微鏡：Olympus BX51，日本奧林巴斯公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 糖尿病大鼠模型的建立 參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)糖尿病大鼠動物模型，將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后,采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠分為2組，每組15只。模型組：大鼠按30mg/kg的劑量腹腔一次性注射2%STZ溶液,以持續(xù)1周空腹血糖≥16.7mmol/L為造模成功。正常對照組：大鼠腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。造模后監(jiān)測大鼠的精神狀況和活動狀況、進(jìn)食量、飲水量以及尿量，每周測體重1次，取材前1d再測體重。造模后第3天及其后每周采尾血測空腹血糖，取材前再測空腹血糖1次。實(shí)驗(yàn)過程中自由進(jìn)食飲水。

1.4.2 血漿胃動素濃度測定 造模成功后，采集腹主動脈血2ml，不抗凝，3 000r/min離心15min，收集血漿，用ELISA法測定血漿胃動素濃度。

1.4.3 胃動力學(xué)指標(biāo)測定 8周后,禁食12h，于次日晨，將1mg/ml的美藍(lán)溶液0.4ml灌胃，30min后，處死大鼠；取全胃，將胃內(nèi)殘留物用0.9%氯化鈉溶液4ml沖洗并收集沖洗液，低速離心機(jī)3 500r/min，離心15min，取上清液，用722分光光度計(jì)在640nm波長檢測吸光度值（OD）。大鼠胃排空情況用胃內(nèi)色素的殘留率表示，胃內(nèi)色素殘留率=測定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值×100%。1.4.4 組織病理學(xué)檢查 取各組大鼠胃壁組織1塊（10mm×10mm×2mm），置于10%中性甲醛溶液中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度為5μm的切片，行HE染色，中性樹膠固定。光鏡下觀察胃壁平滑肌組織病理變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析。上述步驟均采用單盲法，未告知研究員分組情況。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 造模后模型組大鼠空腹血糖濃度持續(xù)＞16.7mmol/L，并出現(xiàn)了多飲、多食及多尿的糖尿病典型癥狀，I型糖尿病造模成功。

2.2 造模后兩組大鼠空腹血糖水平的比較 見表1。

表1 造模后兩組大鼠空腹血糖水平的比較（mmol/L）

由表1可見，與正常對照組比較，Ⅰ型糖尿病模型組大鼠各個時點(diǎn)的平均空腹血糖濃度均明顯升高（均P＜0.01）。

2.3 造模后兩組大鼠體重的比較 見表2。

表2 造模后兩組大鼠體重的比較（g）

由表2可見，Ⅰ型糖尿病模型組大鼠造模1周后體重較正常對照組明顯低（均P＜0.01）。

2.4 兩組大鼠胃腸動力學(xué)及血漿胃動素水平的比較 見表3。

表3 兩組大鼠胃腸動力學(xué)及血漿胃動素水平的比較

由表3可見，Ⅰ型糖尿病模型組大鼠的胃內(nèi)色素殘留率、空腹和餐后血漿胃動素水平均明顯高于正常對照組（P＜0.05或0.01）。

2.5 胃動力與空腹血糖、胃動素的相關(guān)分析 Pearson相關(guān)分析顯示，Ⅰ型糖尿病模型組大鼠胃內(nèi)色素殘留率與空腹血糖濃度、血漿胃動素濃度均呈正相關(guān)（r= 0.826、0.793，均P＜0.05）。

2.6 胃平滑肌組織病理變化各組大鼠胃平滑肌組織光鏡下觀察 與正常對照組相比，STZ誘導(dǎo)Ⅰ型糖尿病模型大鼠胃壁組織中的平滑肌細(xì)胞有不同程度的肌細(xì)胞排列紊亂，提示胃壁組織的平滑肌細(xì)胞病變，詳見圖1。

3 討論

圖1 光鏡下觀察各組大鼠胃壁平滑肌組織結(jié)構(gòu)變化（A：正常對照組，B：模型組；HE染色，×100）

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠采用STZ腹腔內(nèi)注射，通過特異性破壞模型組大鼠的胰島β細(xì)胞，減少胰島素分泌，誘發(fā)Ⅰ型糖尿病。實(shí)驗(yàn)期間模型組大鼠空腹血糖濃度持續(xù)＞16.7mmol/L，平均體重明顯低于正常對照組，并出現(xiàn)了多飲、多食及多尿的糖尿病典型癥狀，Ⅰ型糖尿病造模成功。本實(shí)驗(yàn)在造模8周后檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠胃內(nèi)色素殘留率增加，顯示胃排空能力明顯下降；本實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠存在胃輕癱表現(xiàn)。

胃動素由Mo細(xì)胞分泌，分布于小腸，是22個氨基酸組成的多肽。它可以影響胃腸運(yùn)動和胃腸電活動，對胃蛋白酶的分泌起促進(jìn)作用，增加胃黏膜血流量但不增加胃酸分泌，使胃體、胃竇及幽門不同區(qū)域的肌細(xì)胞強(qiáng)烈收縮，并能誘發(fā)胃和小腸的移行性運(yùn)動復(fù)合波MMCⅢ相[4]，導(dǎo)致胃產(chǎn)生明顯的收縮運(yùn)動和小腸明顯的分節(jié)運(yùn)動，對胃排空起到一定的促進(jìn)作用，同時對胃腸道內(nèi)容物的清除也發(fā)揮了積極的作用。在既往的研究中，胃動素的釋放量被認(rèn)為與胃腸動力呈正比，即胃動素釋放減少，胃腸蠕動減慢；胃動素釋放減少，胃腸動力降低[5]。

而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)發(fā)生胃輕癱的Ⅰ型糖尿病模型組大鼠與正常對照組比較，有更高的血漿胃動素水平，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析顯示，模型組的胃內(nèi)色素殘留水平與胃動素水平存在正相關(guān)關(guān)系。一些針對Ⅱ型DGP患者的臨床研究同樣顯示DGP患者的血漿胃動素水平較胃排空正常者高[6-7]，與本動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。腸神經(jīng)系統(tǒng)及平滑肌細(xì)胞都有胃動素受體的分布[8]，提示胃動素的作用可能是通過神經(jīng)通路和對平滑肌的直接作用共同完成的。有研究表明糖尿病模型大鼠的腸神經(jīng)系統(tǒng)功能及形態(tài)結(jié)構(gòu)均顯示異常,腸神經(jīng)系統(tǒng)的腎上腺能神經(jīng)纖維腫脹、變性或神經(jīng)缺失，還有小腸肌間神經(jīng)叢膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的缺失和膽堿酯酶活性增加[9]。同時在體外高糖濃度下的細(xì)胞培養(yǎng)到對糖尿病大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，糖尿病可致不同部位細(xì)胞凋亡[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)在第8周STZ誘導(dǎo)糖尿病模型大鼠胃壁組織中的平滑肌細(xì)胞均有明顯的空泡變性，伴有不同程度的肌細(xì)胞排列紊亂，提示胃壁組織的平滑肌細(xì)胞病變。這可能導(dǎo)致胃動素對平滑肌的直接作用的減弱，使胃動素代償性釋放增加。

本研究顯示Ⅰ型糖尿病模型組大鼠的血糖水平與胃內(nèi)色素殘留水平呈正相關(guān)。高血糖可影響胃電起步點(diǎn)，使胃電節(jié)律紊亂，胃竇收縮減弱，頻率減少，增加孤立性幽門收縮波；減慢正常人及糖尿病患者的胃排空[12]。胃排空延遲所致的胃潴留，胃壁持續(xù)擴(kuò)張和松弛，加之胃內(nèi)容物中脂肪和蛋白質(zhì)的刺激，也可使胃動素釋放增加[13]。

綜上所述，Ⅰ型糖尿病大鼠的胃動力并沒有隨血漿胃動素濃度升高而增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)了一定程度的降低。有研究稱應(yīng)用胃動素受體激動劑可改善DGP患者的臨床癥狀[14]，我們推測可能有胃動素抵抗的發(fā)生。我們需要進(jìn)一步的研究以闡明其中的機(jī)制。

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Relationship between motilin and gastric motility in diabetic rats

Objective To investigate the relationship between motilin and gastric motility in type I diabetic rats．Methods Thirty Wistar rats were randomly divided into model group and control group．Type I diabetes was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)30mg/kg in model rats,and rats in control group received same volume of normal saline．Gastric emptying rate was determined by methylene blue gavage method．Plasma motilin concentration was determined by ELISA method．Eight weeks later,gastric smooth muscle tissue structure changes were observed． Results Compare with control group,the plasma motilin concentration was significantly higher and the gastric emptying rate was significantly lower in model group(both P＜0．05)．The morphological study showed the structural disorder of gastric smooth muscle tissue．Conclusion The plasma motilin concentration increases and gastric motility is reduced in type I diabetic rats,which may be associated with pathological changes of gastric smooth muscle and motilin resistance．

Pathogenesis of diabetic Gastroparesis Gastric motilin gastric motility

2014-08-12）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃（2012ZA068）

310005 杭州,浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科（曹燕飛、張咩慶、陳宏達(dá)、王陳芳）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科（杜靜靜）

張咩慶，E-mail：zhangMG5569@sina.com