江若安 葉楓 王新宇

抑制TUBA1C的過表達(dá)在卵巢癌細(xì)胞株CAOV3、SKOV3細(xì)胞增殖侵襲中的作用機(jī)制探討

江若安 葉楓 王新宇

目的探討抑制α-微管蛋白特異性1c鏈（TUBA1C）過表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞株CAOV3、SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲的影響，初步闡明TUBA1C在上皮性卵巢癌中的作用機(jī)制。方法 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)抑制TUBA1C基因的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAOV3、SKOV3細(xì)胞，CAOV3分為3組：CAOV3實(shí)驗(yàn)組、CAOV3空載體轉(zhuǎn)染組和CAOV3空白對(duì)照組；SKOV3分為3組：SKOV3實(shí)驗(yàn)組、SKOV3空載體轉(zhuǎn)染組和SKOV3空白對(duì)照組。采用RT-PCR法檢測(cè)TUBA1C表達(dá)；CCK-8法及Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)TUBA1C基因抑制后對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響。結(jié)果 靶向TUBA1C基因的siRNA明顯、特異性地抑制TUBA1C mRNA的表達(dá)水平；培養(yǎng)72h CAOV3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較空載體轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SKOV3實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量為（0．95±0．12）個(gè)/視野，較空載體轉(zhuǎn)染組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），CAOV3實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量為（1．13±0．14）個(gè)/視野，較空白對(duì)照組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論 抑制TUBA1C基因過表達(dá)可抑制CAOV3、SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲能力，有望成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。

TUBA1C 卵巢腫瘤 小分子干擾RNA 細(xì)胞增殖 腫瘤侵襲

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，約90%為上皮性卵巢癌[1]，其中75%的病例在初診時(shí)已有腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)，而決定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)力的是由微管、微絲等構(gòu)成的細(xì)胞骨架。微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白聚集而成的二聚體。既往較多研究集中于β-微管蛋白，且注重于其與紫杉醇的耐藥相關(guān)性上，而少有α-微管蛋白的研究。近來有研究發(fā)現(xiàn)α-微管蛋白在乳腺癌組織中較正常和癌前病變組織中表達(dá)顯著升高，并與患者的生存率相關(guān)[2]。已有少量前沿文獻(xiàn)提示α-微管蛋白在乳腺癌及肺癌等腫瘤中作用，鮮有α-微管蛋白與婦科腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究。我們的前期研究中已確認(rèn)在上皮性漿液性卵巢癌的蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)現(xiàn)α-微管蛋白特異性1c鏈（TUBA1C）在漿液性卵巢癌中表達(dá)上調(diào)[3]，因此認(rèn)為TUBA1C與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。本文在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，抑制卵巢癌細(xì)胞株CAOV3、SKOV3中的TUBA1C過表達(dá)，探討TUBA1C在上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞分組 卵巢癌細(xì)胞株CAOV3分為3組：CAOV3實(shí)驗(yàn)組、CAOV3空載體轉(zhuǎn)染組和CAOV3空白對(duì)照組。卵巢癌細(xì)胞株SKOV3分為3組：SKOV3實(shí)驗(yàn)組、SKOV3空載體轉(zhuǎn)染組和SKOV3空白對(duì)照組。

1.2 主要試劑和儀器 （1）試劑材料：真核過表達(dá)及siRNA質(zhì)粒由上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司提供；1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、Gibco及 Lipofectamine2000（trizol）由上海普飛生物公司提供；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Qiagen）、一抗、二抗（Santa Cruz Biotechnology）由上海吉泰生物有限公司提供；E.coli DH-5α由浙江省女性生殖健康研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8）由上海生工提供；Taq酶、dNTP、sybrgreen和逆轉(zhuǎn)錄酶（takara）由杭州浩嘉代理提供。（2）實(shí)驗(yàn)室儀器：蛋白電泳儀及Real time PCR儀（CFX96）由美國bio-rad公司制造；流式細(xì)胞儀由美國BD公司制造；分光光度計(jì)（nanodrop 1000）由美國Thermo Fisher Scientific公司制造；CO2培養(yǎng)箱（MCO-17AIC）由日本三洋公司制造；超低溫冰箱由美國NBS公司制造；高速冷凍離心機(jī)（5817R）及常溫離心機(jī)（5814）由美國eppendorf公司制造；倒置顯微鏡由日本Olimpus公司制造；純水儀由美國Millipore公司制造。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟和方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 卵巢癌CAOV3、SKOV3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度5%CO2孵箱中無菌培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24h種板，待細(xì)胞融合度達(dá)90%～95%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1～2h棄掉培養(yǎng)基，加入2ml不含血清的opti-MEM培養(yǎng)基（不含雙抗）混懸Lipofectamine 2000及siRNA，轉(zhuǎn)染4～6h后換成含雙抗和血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育；轉(zhuǎn)染24h后加入最適篩選濃度的G418，每3d更換1次含有G418的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)10d后，使用G418的維持濃度繼續(xù)培養(yǎng)15d。轉(zhuǎn)染后以RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)TUBA1C基因?qū)AOV3、SKOV3細(xì)胞增殖的影響 分組同1.1，處理同1.3.1。轉(zhuǎn)染成功后，分別于24、48和72h終止培養(yǎng)，加入CCK-8（5mg/ ml）10μl，繼續(xù)孵育0.5～4h后吸盡孔內(nèi)液體，在450nm測(cè)定吸光度，讀取各孔光密度（D）值并計(jì)算增殖抑制率，最后繪制增殖曲線圖。增殖抑制率（%）=（各空白對(duì)照組D值-相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組D值）/相應(yīng)空白對(duì)照組D值×100%。

1.3.3 Transwell法檢測(cè)CAOV3、SKOV3細(xì)胞侵襲 分組同1.1，處理同1.3.1。以Matrigel膠均勻平鋪于Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜上模擬人工基底膜。轉(zhuǎn)染后6h消化，離心重懸細(xì)胞待用。將已處理的各組細(xì)胞懸液接種至Transwell小室內(nèi)，將小室放入含趨化因子及培養(yǎng)液的24孔板，37℃、5%CO2條件下孵育24h后顯微鏡下觀察膜下不同的5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以示，組間比較進(jìn)行方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)TUBA1C基因抑制效率 見表1。

表1RT-PCR檢測(cè)CAOV3、SKOV3中TUBA1C mRNA表達(dá)

TUBA1C基因干擾效率在CAOV3、SKOV3細(xì)胞中分別為58.8%及45.2%，CAOV3及SKOV3實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)分別與CAOV3、SKOV3空載體轉(zhuǎn)染組及CAOV3、SKOV3空白對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而空載體轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組相比，TUBA1C表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可排除非特異性基因沉默。2.2 CCK-8法檢測(cè)TUBA1C基因抑制后細(xì)胞增殖 見圖1-2。

由圖1可見，培養(yǎng)24h時(shí)CAOV3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率為0.180±0.003，CAOV3空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率為0.219±0.004，CAOV3空白對(duì)照組細(xì)胞增殖率為0.165± 0.002；培養(yǎng)48h時(shí)CAOV3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率為0.198± 0.002，CAOV3空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率為0.229±0.015，CAOV3空白對(duì)照組細(xì)胞增殖率為0.166±0.001；培養(yǎng)72h時(shí)CAOV3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率為0.208±0.011，而CAOV3空載體轉(zhuǎn)染組及CAOV3空白對(duì)照組細(xì)胞增殖率分別為0.299±0.001及0.286±0.005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

由圖2可見，培養(yǎng)24h時(shí)SKOV3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率為0.160±0.002，SKOV3空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率為0.163±0.005，SKOV3空白對(duì)照組細(xì)胞增殖率為0.168± 0.003；培養(yǎng)48h時(shí)SKOV3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率為0.203± 0.009，SKOV3空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率為 0.177± 0.002，SKOV3空白對(duì)照組細(xì)胞增殖率為0.181±0.001；培養(yǎng)72h時(shí)SKOV3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率為0.185±0.004，SKOV3空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率為 0.196±0.003，SKOV3空白對(duì)照組細(xì)胞增殖率為0.197±0.001。差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TUBA1C基因抑制后各組細(xì)胞侵襲能力 見圖3-4。

圖1 TUBA1C抑制后CAOV3細(xì)胞增殖曲線（注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與空載體轉(zhuǎn)染組比較，▲P＜0.05）

圖2 TUBA1C抑制后SKOV3細(xì)胞增殖曲線

圖3 Transwell侵襲小室檢測(cè) CAOV3細(xì)胞的侵襲能力（A：CAOV3空載體轉(zhuǎn)染組；B：CAOV3實(shí)驗(yàn)組；HE染色，×200）

圖4 Transwell侵襲小室檢測(cè) SKOV3細(xì)胞的侵襲能力（A：SKOV3空載體轉(zhuǎn)染組；B：SKOV3實(shí)驗(yàn)組；HE染色，×200）

由圖3可見，CAOV3實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量為（1.13±0.14）個(gè)/視野，較CAOV3空載體轉(zhuǎn)染組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

由圖4可見，SKOV3實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量為（0.95±0.12）個(gè)/視野，較SKOV3空載體轉(zhuǎn)染組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

對(duì)于微管蛋白的研究，既往較多研究集中于β-微管蛋白，發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中β-微管蛋白的表達(dá)異常，并與抗腫瘤藥物的耐受性有關(guān)。近年來逐漸有學(xué)者開始對(duì)α-微管蛋白在多種腫瘤發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究。

應(yīng)榮彪等[3]發(fā)現(xiàn)α、β-微管蛋白的表達(dá)在乳腺正常組織、乳腺非典型增生組織、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織和浸潤性癌組織中呈逐漸增高趨勢(shì)，認(rèn)為乳腺癌前病變中已有中心體α、β-微管蛋白的過表達(dá)，得出α、β-微管蛋白的過表達(dá)可能在促使細(xì)胞過度增殖惡性轉(zhuǎn)化的過程中起到重要作用。陳清勇等[4]通過采用免疫組化及Western blot方法檢測(cè)α-微管蛋白和多耐藥基因1（MDR1）的在原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)α-微管蛋白在Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期NSCLC中的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），多因素生存分析認(rèn)為α-微管蛋白（RR=3.287，P=0.006）可作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，從而得出α-微管蛋白在肺癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展中有一定作用的結(jié)論。此外，呂玉宇等[5]通過探討α、β、γ-微管蛋白在人鱗狀上皮宮頸永生化細(xì)胞（H8細(xì)胞株）和癌細(xì)胞（Caski細(xì)胞株）的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)α、β、γ-微管蛋白，Caski細(xì)胞中的表達(dá)量高于H8細(xì)胞，從而認(rèn)為中心體α、β、γ-微管蛋白異常可能是宮頸癌細(xì)胞惡性表型的特征之一。

而對(duì)于TUBA1C的研究尚少，目前僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道其在骨腫瘤細(xì)胞中的相關(guān)研究。Li等[6]利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析法發(fā)現(xiàn)，與良性骨腫瘤相比，骨肉瘤組織有數(shù)個(gè)相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，其中就包括TUBA1C，表明這些被發(fā)現(xiàn)的蛋白包括TUBA1C在骨肉瘤的發(fā)生和治療中可能是潛在的生物標(biāo)記物，在骨肉瘤中異常表達(dá)的細(xì)胞骨架微管相關(guān)蛋白，通過影響微管的穩(wěn)定性，影響腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移,從而影響患者的預(yù)后。而Li等[7]首次報(bào)道在上皮性漿液性卵巢癌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)TUBA1C在漿液性卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，為研究TUBA1C在婦科腫瘤，特別是上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中的機(jī)制開啟了新的篇章。

腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)可促進(jìn)其穿過基底膜向鄰近組織甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，與腫瘤的惡性程度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)予TUBA1C抑制后，癌細(xì)胞株增殖及侵襲能力可能也受到影響，證實(shí)了TUBA1C的下調(diào)能降低卵巢癌細(xì)胞體外增殖能力及侵襲能力，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型，TUBA1C有望成為卵巢癌抗腫瘤藥物耐受、基因治療的新靶點(diǎn)。

目前臨床上對(duì)卵巢癌的診治原則是早期發(fā)現(xiàn)，早期手術(shù)，輔以放化療和綜合支持治療，晚期以改善患者的生存質(zhì)量為首要目的。TUBA1C作為腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的重要參與者，可以作為無損傷性腫瘤篩查的指標(biāo)，在治療方面，探討TUBA1C與抗腫瘤藥物之間的作用機(jī)制，從基因啟動(dòng)到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行干預(yù)，可能將有效地降低腫瘤的生物學(xué)惡性程度，延長患者的生存時(shí)間，提高其生存質(zhì)量。

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Silencing over-expression of TUBA1C inhibits proliferation and invasion of human ovarian carcinoma CAOV3,SKOV3 cells

ObjectiveTo investigate the effect of silencing the over-expression of alpha-tubulin specific 1c chain(TUBA1C)gene on the proliferation and invasion of human ovarian carcinoma CAOV3 and SKOV3 cells． Methods TUBAIC sequencing-targeting siRNA was transfected into human ovarian carcinoma CAOV3 and SKOV3 cells．The expressions of TUBAICmRNA was examined by RT-PCR,the proliferation and invasion ability of CAOV3 and SKOV3 cells were evaluated by CCK-8 assay and Transwell assay,respectively．Results The TUBA1C sequence-specific siRNA effectively and specifically down-regulated the expression of TUBA1CmRNA．The CCK-8 results showed that the proliferation of cultured CAOV3 cells in experimental was significantly inhibited compared with those in control and negative transfection groups(P＜0．05)．The penetrating capacity of SKOV3 cells in the experimental group(0．95±0．12 cells/field)was significantly inhibited compared with those in the negative group(P＜0．01);however there was no significant differnce in CAOV3 cells between experimental group and negative group．Conclusion Silencing TUBA1C can effectively inhibit the proliferation and invasion of human ovarian carcinoma CAOV3 and SKOV3 cells,suggesting TUBA1C gene may be a potential new target for treatment of ovarian carcinoma．

TUBA1C Ovarian tumors Small interfering RNA Cell proliferation Neoplasm invasiveness

2013-05-20）

（本文編輯：楊麗）

浙江省衛(wèi)生廳一般項(xiàng)目（2010KYA127）

310009 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院腫瘤科

王新宇，E-mail：Wangxy@zju.edu.cn