王亞潔，趙陽國，2＊＊，白 潔，2，師振華，王俊彩

（中國海洋大學1.環(huán)境科學與工程學院；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島266100）

生物能源的開發(fā)利用是緩解全球能源壓力、保障能源安全的重要途徑。其中生物柴油以其較高的可持續(xù)性和清潔無污染的特點成為全球關注的焦點。在制備生物柴油的原料中，微藻處于領先地位，特別是硅藻。硅藻是自養(yǎng)的真核微藻，有200多個屬，估計有近10萬個種[1－2]。從如此海量的微藻中篩選生長迅速、含油量高的優(yōu)質微藻是發(fā)展微藻能源的首要條件，也是實現(xiàn)微藻生物柴油產業(yè)化的主要瓶頸[3]。目前，微藻分離等工作已經取得較快發(fā)展[4－6]，但對藻株生長和油脂條件缺乏認識，從而限制了其進一步應用。有學者通過改變微藻生長所需的營養(yǎng)和環(huán)境條件，提高了硅藻的脂質含量[7－11]，同時認為，要使微藻脂肪酸產量最大化，必須首先使微藻產量最大化[12]。可見，篩選優(yōu)質微藻并對分離藻株的生長和油脂積累條件進行深入分析，可為微藻生物柴油研究提供基礎材料，同時也可為微藻擴大化培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)參考。

本研究從青島近岸海域分離純化出一株海洋微藻，鑒定為硅藻門的小頭菱形藻（Nitzschiamicrocephala），進一步研究了不同濃度硝態(tài)氮、部分金屬離子對其生長與油脂積累的影響，同時選取對其影響較大的環(huán)境因子進行正交試驗，探討最佳培養(yǎng)條件，為菱形藻的擴大培養(yǎng)提供理論基礎和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 微藻的分離與鑒定

1.1.1 海水樣品 本實驗分離微藻所用海水樣品取自青島市石老人海水浴場附近海域。

1.1.2 微藻的分離與培養(yǎng) 研究采用微吸管法分離微藻，分離獲得的微藻培養(yǎng)于f/2培養(yǎng)基中[13]。配制培養(yǎng)基的海水取自青島膠州灣，經0.45μm膜過濾并高溫高壓滅菌后使用。將分離出的藻種接種到盛有600mL培養(yǎng)液的錐形瓶中；然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度（22±1）℃，光照強度3 500lx，光暗比12h∶12h，每天定時搖晃3次。

1.1.3 掃描電鏡觀察 應用掃描電鏡對微藻觀察照相前，采用過氧化氫與超聲波聯(lián)合清洗微藻細胞壁的前處理方法[14]。具體步驟為，用2mL塑料離心管離心收集實驗室培養(yǎng)微藻，加20%～30%H2O2重新懸浮，然后放入超聲波清洗儀（KQ－250DE，江蘇昆山）中振蕩1～2min，以去掉硅藻細胞的原生質體及其外部附著的雜質。繼以1 000×g離心10min收集藻體，加1mL 1%戊二醛固定2～3h，1 000×g離心10min，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次。然后依次用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇進行逐級脫水，用吸管將含有樣品的乙醇溶液滴在有明膠膜的蓋玻片上，可防止細胞被沖走，用臨界點干燥法干燥，用離子濺射鍍膜法鍍膜[15]。

1.1.4 微藻18SrDNA及18S～23S間隔區(qū)測序 取5mL新鮮藻液1 000×g離心1min收集藻細胞沉積。應用微生物DNA提取試劑盒（Mobio，USA），通過化學裂解－物理破碎過程提取微藻總DNA。自GenBank中下載硅藻18SrDNA序列，通過對齊后檢索保守區(qū)域，設計18SrDNA 引物，正向引物 Guizao18S－F：5′－CGTCTCAAAGATTAAGCCATGC－3′，反向引物Guizao18S－R：5′－TCCGCAGGTTCACCTA CGGA－3′，預計擴增1 800bp。18S～23S間隔區(qū)序列引物應用真核微生物通用引物，正向引物ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′，反向引物ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGATAT GC－3′，預計擴增800～1 200bp。PCR擴增產物通過切膠回收后插入pMD19－T載體（寶生物，大連），并轉化到E.coliDH5α。通過氨芐抗性、藍白斑以及PCR擴增檢測后挑取陽性克隆提交給南京金斯瑞生物公司測序。

1.1.5 序列分析 將該微藻的18SrDNA序列與GenBank中近緣藻的序列一起用ClustalW軟件[16]進行多序列對齊，用 MEGA 4.0軟件[17]中的相鄰法建系統(tǒng)進化樹，重復1 000次計算bootstrap值。該微藻18S rDNA及18S～23S間隔區(qū)序列已提交至GenBank中，登錄號為KC759159。

1.2 微藻生物量和油脂的定量分析

1.2.1 生物量測定 采用可見光分光光度法來測量微藻的生物量。根據(jù)前期研究，在一定濃度范圍內，藻類細胞生物量與吸光度呈正比[18]。每隔24h取一定量的藻液，用722N型可見光分光光度計（上海精科）測定其在750nm處的吸光度（OD值）。

1.2.2 油脂含量測定 微藻細胞內油脂經尼羅紅（NileRed）染色后，在激發(fā)波長為480nm條件下，可于波長為575nm處檢測到與油脂含量成正相關的熒光。每隔24h取一定量的藻液，調整其濃度至OD750nm＝0.040，用濃度為1μg/mL的NileRed溶液對藻液染色15min[19]，應用F4600型分子熒光光度計（日立公司，日本）在波長為480nm處激發(fā)后，檢測其波長為575nm處的熒光值。

油脂的絕對含量采用氯仿－甲醇法[20]測定，油脂含量和油脂產率通過公式計算：

式中：C油為油脂含量（%）；W油為油脂質量（mg）；W藻為藻粉干重（mg）；P油為油脂產率（mg/L）；V藻為藻液體積（L）。

1.3 藻株生長和油脂積累條件優(yōu)化

1.3.1 單因子對藻株生長和油脂積累的影響 以f/2培養(yǎng)基為基礎，按照表一中的濃度梯度分別加入NaNO3、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、ZnSO4·7H2O、Na2SiO3·9H2O，探討該藻株在單一因素改變的條件下（即pH、NO－3、Mg2＋、Fe3＋、Zn2＋或改變，其他營養(yǎng)元素按f/2培養(yǎng)基添加），藻株生長及油脂含量變化情況。

表1 本研究采用的單因素梯度Table 1 Gradient of single factor in this study

1.3.2 藻株的生長及產油條件優(yōu)化 通過單因子方差分析的方法研究發(fā)現(xiàn)，pH、和Fe3＋對該藻株的生長及油脂含量影響較大，故該試驗階段選取pH、和Fe3＋3個影響因子，以f/2培養(yǎng)基為基礎，組合對藻株的生長及產油條件進行優(yōu)化。采用正交試驗設計軟件對其培養(yǎng)條件進行設計按L3（34）正交表進行設計，如表2（其他營養(yǎng)元素按f/2培養(yǎng)基添加）。

表2 菱形藻優(yōu)化培養(yǎng)正交設計因素水平表Table 2 Orthogonal design for optimum growth conditions of Nitzschiasp.Som

1.3.3 統(tǒng)計分析 應用 Excel 2003（Microsoft Corporation，USA）進行標準偏差分析；單因子方差分析由Statistica軟件（StatSoft，Inc.）計算獲得。

2 結果與討論

2.1 藻株的形態(tài)學特征

圖1為電鏡下觀察到的較完整的細胞，細胞呈細長橢圓形，兩端微尖，長度約16μm。殼面花紋呈點狀和輻射狀，無中央節(jié)和端節(jié)。殼縫細長，其內側的龍骨點明顯，細胞單獨生活，據(jù)此推斷該藻株為菱形藻（Nitzschiasp.）。根據(jù)形態(tài)特征及分離地點石老人（Stone Old Man）海水浴場，初步將這株藻命名為菱形藻Som（Nitzschiasp.Som）。

圖1 藻株在掃描電子顯微鏡下的形態(tài)特征Fig.1 Morphology of the microalgae under electron microscope

2.2 18SrDNA序列分析與藻株鑒定

為獲得該藻株的分類學地位，對其18SrDNA和18S－23S間隔區(qū)進行PCR擴增和測序，獲得該藻18S rDNA序列1 744bp，18S～23S間隔區(qū)序列1 038bp。應用該藻18SrDNA序列與相似序列構建系統(tǒng)進化樹（見圖2）。根據(jù)該圖，發(fā)現(xiàn)硅藻Som與菱形藻屬中部分藻種聚為一類，其中與小頭菱形藻（N.microcephalaBA100，登錄號：HM805041）18SrDNA序列最相似（＞99%），僅有2個堿基差異。

對比發(fā)表的典型小頭菱形藻（N.microcephalaGrunow 1880），發(fā)現(xiàn)二者在形態(tài)上除了具有網(wǎng)孔、邊齒等相同特征外，存在很大區(qū)別。典型的小頭菱形藻兩端明顯變細，似紡錘狀，而本研究中分離到的藻株兩端收縮不明顯，這可能是由于地域或環(huán)境條件差異導致的形態(tài)變異。該藻種最初于1878年由Cleve和M9ller記錄[21]，到目前為止，該藻種在歐洲各國、巴西、美國、新西蘭等都有過發(fā)現(xiàn)和報到，我國也有該藻的記錄[22]。該藻殼面細長，上有連續(xù)細微的邊緣凹面，兩端延長變窄呈圓形，有12～16根明顯的腓骨，長約10μm。殼紋不明顯，僅在一些樣品中可以分辨。

圖2 本實驗分離到的小頭菱形藻Som 18SrDNA序列與相似序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Polygenetic tree based on 18SrDNA of Nitzschiamicrocephala Som and the similar sequences

綜上所述，根據(jù)形態(tài)特征和18SrDNA序列比較，將分離到的該硅藻命名為小頭菱形藻Som（Nitzschia microcephalaSom）。

2.3 環(huán)境因子對藻株生長和油脂積累的影響

一般海洋藻類生存的適宜pH值與海水的pH值相近，pH＝8.3左右。不同的藻類生活的適宜pH值不同，偏離此pH值，微藻生長和體內有關代謝活動即受影響。本實驗分離到的菱形藻較適pH為6～8（見圖3a）。其中，pH＝8條件下菱形藻生長速率最高，約為0.01d－1。結合該條件下的生長曲線可以看出，菱形藻油脂的積累主要在其對數(shù)末期。在pH＝6的條件下，菱形藻的油脂積累量第12天達到最大。而在pH＝10的條件下，菱形藻的油脂含量明顯低于其他pH條件下的油脂含量，這表明在強堿性條件下，菱形藻的脂類合成受到了抑制。王秀良等[23]發(fā)現(xiàn)在pH＝9.8的條件下，眼點擬微綠球藻的總脂含量明顯低于其他pH條件下的總脂含量，這表明在強堿性條件下，眼點擬微綠球藻的脂類合成受到了抑制，與本研究一致。

文獻[24]顯示，當硝氮濃度達到8mmol/L時，三角褐指藻的生長受到抑制，如圖3b不同濃度硝氮對菱形藻生長的影響不大。菱形藻Som的油脂積累曲線與生長曲線所呈現(xiàn)的趨勢有明顯的差異。當?shù)獫舛葹?.6mmol/L時，菱形藻的油脂積累一直維持在較低水平，而當?shù)獫舛葹?.8mmol/L時，菱形藻的油脂積累略顯優(yōu)勢，在整個培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)了3次峰值，其值約是氮濃度為0.6mmol/L時的2倍?？梢钥闯?，實驗所設定的不同氮濃度下菱形藻的生長并沒有顯著的差異，但油脂積累有較大的差異。

圖3 單因子對小頭菱形藻Som生長和油脂積累的影響Fig.3 Effects of single factor on N.microcephala Som growth and lipid accumulation

由圖3c可以看出，不同 Mg2＋濃度對菱形藻的生長影響不明顯，而在培養(yǎng)基中加入Mg2＋能夠明顯的提高菱形藻的油脂積累量，在Mg2＋濃度為0.3mmol/L條件下，菱形藻的熒光值在第12天達到最高值。這是可能是由于Mg2＋對植物脂肪酸合成關鍵酶ACCase的活性有一定的影響，Mg2＋濃度的變化可以提高該酶的活性[25]。但不同 Mg2＋濃度條件下，菱形藻Som油脂積累差別不大。

由圖3d可以看出，F(xiàn)e3＋濃度對菱形藻的生長具有顯著影響。Fe3＋的濃度越高，菱形藻的生長速率越大，進入穩(wěn)定期越晚，藻的生長周期也更長。Fe3＋能夠影響葉綠素a和某些含F(xiàn)e輔酶的合成，進而使藻細胞的光合作用系統(tǒng)受到抑制[26]，從而影響了藻細胞的代謝和生長。與菱形藻的生長曲線相比，油脂積累曲線所反映出的Fe3＋濃度對菱形藻油脂積累的影響并不十分顯著，并且，可以看出Fe3＋的濃度越高，菱形藻的油脂積累量越小，在第16天，F(xiàn)e3＋濃度為0.01μmol/L的條件下，達到最大值。但很多研究證實Fe3＋對微藻的生長及脂質積累均具有促進作用，且影響較顯著，如Liu等[27]以小球藻為研究對象，發(fā)現(xiàn)Fe3＋對小球藻的生長及油脂積累均具有促進作用。這可能是由于培養(yǎng)基中的Fe3＋形成膠體態(tài)和顆粒態(tài)鐵[28]，一般認為這2種形態(tài)的鐵不能被浮游植物直接利用[29]。膠體態(tài)鐵可在光還原的作用下轉化成Fe3＋和Fe2＋，從而被藻類利用。所以微藻能真正大量利用的是可溶性有機絡合態(tài)鐵[30－31]。而在 Fe3＋限制條件下，鐵還原酶活性增加，培養(yǎng)基中的鐵被微藻充分利用，而當Fe3＋增加，大多數(shù)Fe3＋形成膠體態(tài)和顆粒態(tài)鐵，無法被微藻直接吸收利用。

與Fe3＋相反，在一定范圍內，較低的Zn2＋濃度較有利于菱形藻的生長（見圖3e）。微量的金屬元素是浮游植物生長所必需的營養(yǎng)成分，但是濃度過高則會產生毒性。由此可見，在Zn2＋濃度為34.8μm/L條件下，Zn2＋對菱形藻產生了毒性作用，限制了菱形藻的生長及油脂的積累。

硅元素是硅藻細胞壁結構的重要組分，并且參與光合色素合成、蛋白質合成、DNA合成和細胞分裂等多種生長代謝過程。培養(yǎng)基中硅（Na2SiO3·9H2O）濃度對菱形藻生長速率和油脂含量的影響如圖3f。在濃度為0.560mmol/L的培養(yǎng)基中，菱形藻的生長緩慢，而且油脂含量在整個培養(yǎng)周期內幾乎沒有變化，水平一直較低。而濃度為0.070mmol/L時，對數(shù)末期熒光值可達到培養(yǎng)初期的4倍以上。一些研究結果表明，硅營養(yǎng)不足會促進脂肪酸在某些微藻體內積累，導致微藻體內脂肪酸增加[32－33]。由此可見，在一定范圍內，較高的濃度明顯的抑制了菱形藻的生長和油脂的積累。相反，低濃度的則促進菱形藻體內油脂的積累。

2.4 菱形藻生長和油脂積累條件的優(yōu)化

不同硅藻對營養(yǎng)鹽的需求有很大的差異，為了探索菱形藻最佳生長和產油的培養(yǎng)基配比，采用正交設計對pH、和Fe3＋3個影響因子組合對藻株的生長及產油條件進行優(yōu)化，得到數(shù)據(jù)應用Statistica軟件對測量數(shù)據(jù)進行處理，直觀分析結果見表3，4。

表3 小頭菱形藻Som生長試驗結果直觀分析表Table 3 Results of visual analysis on growth experiment of N.microcephala Som

表4 小頭菱形藻Som油脂積累藻試驗結果直觀分析表Table 4 Results of visual analysis on oil accumulation experiment of N.microcephala Som

從表3可以看出，對于生長狀況，A2相對較好，并且A因素是該指標的較次要因素；但對于油脂含量方面（見表4）應取A3，而且A因素是該指標的主要因素，在確定最有水平時應該重點考慮。并且，從ki上可以看出，A2和A3對菱形藻生長狀況影響較小，而對油脂含量的影響較大。故綜合考慮，選擇A3。

如表3所示，對于生長狀況，應取B3；但對于油脂含量方面，B2相對較好。另外，對于生長狀況，B因素處于末位的次要因素，而對于油脂含量方面（見表4），B因素是較次要因素。并且，從ki上可以看出，B2和B3對菱形藻生長狀況影響較小，而對油脂含量的影響較大。因此，根據(jù)B因素對2個指標的不同重要程度，選B2。

對于2個指標來說，都是以C3為最佳水平，所以選C3。

綜合上述的分析，最優(yōu)方案為A3B2C3，可見，菱形藻培養(yǎng)和油脂含量的最優(yōu)方案是：培養(yǎng)基初始pH＝9，濃度為0.070mmol/L，F(xiàn)e3＋濃度為100μmol/L。

3 結語

本研究分離到一株硅藻，經形態(tài)學和分子生物學鑒定為小頭菱形藻（Nitzschiamicrocephala）。該藻株的油脂積累主要集中在生長的對數(shù)末期，pH、和Fe3＋對菱形藻的生長及油脂含量影響顯著。實驗室內小頭菱形藻培養(yǎng)及油脂積累的最佳方案為培養(yǎng)基初始pH＝9，濃度為0.07mmol/L，F(xiàn)e3＋濃度為100μmol/L，該條件下，菱形藻的生物量和最大細胞密度值分別為94.7 mg/L和3.5×104cell/mL，油脂含量和油脂產率分別達到19.6%和18.56mg/L。

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