劉宇欣，李紅玉，嚴(yán) 鵬

遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州 121000

海龍蛋白質(zhì)提取物誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)制

劉宇欣，李紅玉，嚴(yán) 鵬

遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州 121000

目的研究海龍蛋白質(zhì)提取物對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及凋亡的誘導(dǎo)作用。方法采用MTT法檢測(cè)蛋白質(zhì)提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況，采用Annexin V/PI流式細(xì)胞分析法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bcl-2、P53的表達(dá)。結(jié)果不同濃度海龍蛋白質(zhì)提取物對(duì)Hela細(xì)胞的增殖有抑制作用，具有時(shí)間和濃度依賴性。Annexin V/PI流式細(xì)胞分析顯示，加藥組早期凋亡率分別為29.18±0.65、39.32±0.78、51.21±1.13、61.56±1.09，與對(duì)照組(9.82±0.18)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；晚期凋亡率加藥組分別為3.20±0.03、7.48±0.06、11.11±0.07、14.60±0.03，與對(duì)照組(1.12±0.09)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著蛋白質(zhì)提取物濃度的升高，Bax、P53蛋白的表達(dá)逐漸升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)逐漸降低。結(jié)論海龍蛋白質(zhì)提取物在一定濃度范圍內(nèi)可在體外抑制Hela細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且隨蛋白質(zhì)提取液濃度的升高，凋亡率顯著增加，可能的機(jī)制是增強(qiáng)促凋亡蛋白Bax、P53的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。

海龍；蛋白質(zhì)提取物；Hela細(xì)胞；凋亡

海龍屬脊索動(dòng)物門硬骨魚綱、海龍目、海龍科。海龍始載于《本草綱目拾遺》，謂“功倍海馬，催生尤捷效”。海龍性溫、味甘、暖水藏、壯陽(yáng)道、消腫塊，故有溫腎壯陽(yáng)，散結(jié)消腫之功效，主治陽(yáng)痿，遺精，腎虛作喘，瘰疬痰核，跌撲損傷，外治臃腫疔瘡[1]。海龍中含有多種氨基酸、脂肪酸和微量元素，還含有多糖和蛋白質(zhì)類物質(zhì)[2]。近年來(lái)，很多文獻(xiàn)報(bào)道海龍?zhí)崛∥锛扔写龠M(jìn)人體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，又有抑制人體癌細(xì)胞株的效果，海龍?zhí)崛∥镞€可促使腫瘤細(xì)胞溶解，且藥物劑量越大，細(xì)胞溶解率越高[2]。而抗癌的有效成分可能是蛋白質(zhì)和多肽類，有研究表明，其蛋白類成分對(duì)肺癌和結(jié)腸癌有抑制作用，而對(duì)宮頸癌的作用未見明確報(bào)道[3]。近年來(lái)宮頸癌發(fā)病率較高，對(duì)其抗癌藥物的研究越來(lái)越受到人們的重視。本文對(duì)海龍中的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行提取分離，并考察其對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響。

材料和方法

1 材料 海龍(購(gòu)自錦州市藥材市場(chǎng))；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(20 ～ 120 kU)(上海金穗生物科技有限公司)；Hela細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)；DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清、胰酶、MTT均購(gòu)自北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；凱基Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；一抗兔抗人Bax、Bcl-2(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；兔抗人P53(Proteintech Group公司)。

2 儀器 SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺(tái)(蘇州江東精密儀器有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀SUNRISE(瑞士TECAN公司)；熒光顯微鏡TE2000-U(日本NIKON公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；043BR119 12BIO-RAD半干轉(zhuǎn)印儀、041BR24044BIO-RAD電泳槽均購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；曝光顯影系統(tǒng)。

3 海龍蛋白質(zhì)的提取 將海龍粉碎，過(guò)篩，精密稱取50 g，按1∶10加入三蒸水，4℃提取24 h，攪拌，使有效成分充分溶解。將粗提液加入2倍體積的硫酸銨(硫酸銨的飽和度為50%)，靜置4 h后8 000 r/min離心30 min，棄上清，用蒸餾水溶解攪拌促溶，待蛋白質(zhì)完全溶解后離心，收集蛋白質(zhì)上清液，將蛋白質(zhì)提取液放入經(jīng)NaHCO3和EDTA處理后的透析袋中，用0.02 mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液平衡，每隔3 h換1次緩沖液，用1%氯化鋇檢查硫酸鹽的除去情況，直到溶液中無(wú)硫酸鹽沉淀為止[4-5]。將透析得到的提取液用Sephadex G-75層析柱進(jìn)一步分離，用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)平衡Sephadex G-75柱(2.6 cm×20 cm)，樣品上樣后用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗脫，流速為0.5 ml/min，收集洗脫液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，得到含量為40%的1組蛋白質(zhì)提取物[6-8]。

4 細(xì)胞培養(yǎng) 取1株Hela細(xì)胞用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液在5% CO2的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞80% ～ 90%貼壁時(shí)按1∶3進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[9]。

5 MTT法檢測(cè)蛋白質(zhì)提取物對(duì)Hela細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，接種于96孔板，每孔100 μl，將培養(yǎng)板放入37℃5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后，加入蛋白質(zhì)提取液，使終濃度分別為0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml，并設(shè)空白對(duì)照組，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，藥物作用24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸棄孔內(nèi)全部上清液，同時(shí)每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，輕微振蕩10 min，混勻后用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)= 490 nm)檢測(cè)各孔吸光值(A值)。按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率并以細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率對(duì)藥物濃度和作用時(shí)間繪制曲線。

6 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將Hela細(xì)胞以密度為1×106/ml接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后，加入濃度分別為0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml的蛋白質(zhì)提取液，另外設(shè)3個(gè)對(duì)照孔，其中兩個(gè)分別加入4 mg/ml的蛋白質(zhì)提取液，剩下1個(gè)孔不加藥，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞2次(2 000 r/min離心5 min)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105～ 5×105/ml，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，藥物處理組分別加入5 μl Annexin VFITC和5 μl PI，混勻，加藥的兩個(gè)孔1個(gè)單染5 μl Annexin V-FITC 1個(gè)單染5 μl PI，不加藥的對(duì)照組不做任何處理，缺失的用量用PBS補(bǔ)足，加好后于室溫、避光條件下反應(yīng)5 ～ 15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)[12-13]。

7 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2和P53蛋白表達(dá)

取5瓶長(zhǎng)滿的Hela細(xì)胞分別加入0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml的蛋白質(zhì)提取液，其中1瓶不加藥的細(xì)胞作為空白對(duì)照，加藥48 h收集細(xì)胞，放入EP管離心，將收集好后的細(xì)胞加入裂解液，將其振蕩混勻，離心取上清，用BCA法測(cè)定細(xì)胞中的蛋白含量，進(jìn)行制樣。制好樣品后配置12%分離膠，5%濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，90 V電壓待進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)電泳到120 V，待出現(xiàn)完整的Mark條帶后終止電泳，20 V 20 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜用封閉液封閉，分別根據(jù)所檢測(cè)的蛋白分子量進(jìn)行裁膜，分組分別用一抗兔抗人Bax(1∶400稀釋)、兔抗人Bcl-2(1∶400稀釋)，兔抗人P53(1∶1 000稀釋)，鼠抗人β-actin (1∶1 000稀釋)4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，兩次孵育后分別用TBST洗膜3次，ECL顯影，上機(jī)檢測(cè)[14]。

8 數(shù)據(jù)處理 用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)用±s表示，多組之間比較采用兩因素析因方差分析和單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法檢測(cè)海龍蛋白質(zhì)提取液對(duì)Hela細(xì)胞抑制率的影響 根據(jù)不同時(shí)間、不同濃度測(cè)得的OD值，按照材料和方法5中的公式計(jì)算出抑制率。由圖1可以看出隨著蛋白質(zhì)提取液濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的抑制率明顯升高，各個(gè)濃度組分別與對(duì)照組進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡 在流式細(xì)胞的左下區(qū)(LL)為正常細(xì)胞，Annexin V及PI均低染(Annexin V- PI-)，右上區(qū)(RU)為死亡或晚期凋亡的細(xì)胞Annexin V及PI均高染(Annexin V+ PI+)，右下區(qū)(LR)為早期凋亡的細(xì)胞Annexin V高染而PI低染(Annexin V+ PI-)(圖2)[15-16]。將各濃度組細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率分別與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

3 Western blot檢測(cè)Bax、P53、Bcl-2的表達(dá) Bax、P53在對(duì)照組的表達(dá)最低，隨著蛋白質(zhì)提取液濃度的升高，兩種蛋白的表達(dá)均逐漸升高，Bcl-2在對(duì)照組表達(dá)最高，實(shí)驗(yàn)組隨著蛋白質(zhì)提取液濃度的升高，蛋白的表達(dá)逐漸降低，3種蛋白各組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3。

表1 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率Tab. 1 Annexin V-FITC/PI flow cytometry showing apoptosis rate of Hela cells (±s, %)

表1 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率Tab. 1 Annexin V-FITC/PI flow cytometry showing apoptosis rate of Hela cells (±s, %)

aP＜0.05, vs 0 mg/ml

ConcentrationEarly apoptosis rateLate apoptosis rate 0 mg/ml9.82±0.181.12±0.09 0.5 mg/ml29.18±0.65a3.20±0.03a 1 mg/ml39.32±0.78a7.48±0.06a 2 mg/ml51.21±1.13a11.11±0.07a 4 mg/ml61.56±1.09a14.60±0.03a

圖 1 海龍蛋白質(zhì)提取液對(duì)Hela細(xì)胞抑制率的影響Fig. 1 Effect of Syngrathus protein extract on proliferation and apoptosis of Hela cells

圖 2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡Fig. 2 Flow cytometry showing apoptosis of Hela cells A: control group； B： 0.5 mg/ml dosing group； C: 1 mg/ml dosing group； D: 2 mg/ml dosing group； E: 4 mg/ml dosing group

圖 3 Western blot 檢測(cè)Bax、P53、Bcl-2 蛋白的表達(dá)情況(P＜0.05)Fig. 3 Western blot showing expression of Bax, P53 and Bcl-2 in Hela cells (P＜0.05) 1: 0 mg/ml; 2: 0.5 mg/ml; 3: 1 mg/ml; 4: 2 mg/ml; 5: 4 mg/ml

討 論

宮頸癌細(xì)胞凋亡與其他細(xì)胞凋亡一樣，可能受到很多凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，參與細(xì)胞凋亡的基因主要分為兩類：促凋亡基因和抑凋亡基因，其中Bax和p53是促凋亡基因，Bcl-2是抑凋亡基因，它們都是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要基因。當(dāng)促凋亡基因表達(dá)過(guò)量時(shí)，抑凋亡基因表達(dá)降低，則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著海龍蛋白質(zhì)提取物濃度的增加，Bax和P53的表達(dá)逐漸升高，而Bcl-2蛋白的表達(dá)則逐漸降低，達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[17-18]。

海龍中蛋白提取物同其他海洋藥物的蛋白類提取物一樣，不僅具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)的作用，還有抗腫瘤的功效，通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步探討了其對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)制，而其他導(dǎo)致凋亡的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，為以后抗宮頸癌藥物的研制提供了一定的依據(jù)。

1 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典［M］. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010： 495.

2 許東暉，謝江海，梅雪婷，等.我國(guó)海龍的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)海洋藥物，2005，24（2）：51-56.

3 劉冬玲，盧振.藥用海洋動(dòng)物海龍的研究概述［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（9）：918-919.

4 王子佳，李紅梅，弓愛君，等.蛋白質(zhì)分離純化方法研究進(jìn)展［J］.化學(xué)與生物工程，2009，26（8）：8-11.

5 王廷華，邢如新，游潮.蛋白質(zhì)理論與技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2005：108-110.

6 羅輕蕾，閆茂倉(cāng)，陳少波，等.美國(guó)紅魚免疫球蛋白的分離純化［J］.科技通報(bào)，2010，26（4）：623-627.

7 張及祿，文慧民，孫德軍.蝮蛇毒小分子多肽的分離、純化及其抗腫瘤作用研究［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2009，30（4）：217-220.

8 何芬，馬旭東，王夢(mèng)月，等.粗吻海龍蛋白質(zhì)組分體外抗腫瘤活性的研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（12）：903-906.

9 Yang PY， Hu DN， Liu FS. Cytotoxic effect and induction of apoptosis in human cervical Cancer cells by Antrodia camphorata［J］. Am J Chin Med， 2013， 41（5）： 1169-1180.

10 李月紅，易建平，王曉燕.噴他脒對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株 Hela 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29（2）：95-97.

11 林濤，李剛，劉青林，等.冬凌草甲素誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，48（8）：8-12.

12 劉文達(dá)，衣服新，惠青山.枸杞多糖聯(lián)合卡鉑對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡作用［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（2）：179-180.

13 張巖巖，康健.中藥艾迪誘導(dǎo)人喉癌細(xì)胞Hep-2凋亡的研究［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33（1）：78-81.

14 李明，劉霞，郭書翰，等.木果楝內(nèi)酯抑制人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞增殖活性的研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（8）：865-868.

15 劉曉霓，李玉潔，楊慶，等.瑞香狼毒提取物體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用比較研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37（10）：1440-1444.

16 Zhang T， Du J， Liu L， et al. Inhibitory effects and underlying mechanism of 7-hydroxyflavone phosphate ester in HeLa cells［J］. PLoS One， 2012， 7（5）： e36652.

17 Archana M， Bastian， Yogesh TL， et al. Various methods available for detection of apoptotic cells--a review［J］. Indian J Cancer， 2013，50（3）： 274-283.

18 呂俊華，沈文娟，韋笑梅，等.荔枝核提取物對(duì)荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響［J］.中成藥，2008，30（9）：1381-1383.

Mechanism of Syngrathus protein extract underlying apoptosis of cervical cancer Hela cells

LIU Yu-xin, LI Hong-yu,YAN Peng
School of Pharmacy, Liaoning Medical College, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China
Corresponding author: LI Hong-yu. Email: lihongyu@163.com

ObjectiveTo study the role of Syngrathus protein extract in inducing proliferation and apoptosis of cervical cancer Hela cells.MethodsThe inhibitory effect of Syngrathus protein extract on growth of Hela cells was tested by MTT assay. Apoptosis of Hela cells was assayed by Annexin V/PI flow cytometry. Expression of Bax, p53 and Bcl-2 in Hela cells was detected by Western blot.ResultsSyngrathus protein extract inhibited the growth of Hela cells in a time- and concentration-dependent manner. Annexin V/PI flow cytometry showed that the early and late apoptosis rate of Hela cells were significantly higher in Syngrathus protein extract treatment group than in control group (29.18±0.65, 39.32±0.78, 51.21±1.13, 61.56±1.09 vs 9.82±0.18, P＜0.05; 3.20±0.03, 7.48±0.06, 11.11±0.07, 14.60±0.03 vs 1.12±0.09, P＜0.05). Western blot displayed that the expression level of Bax and P53 protein increased while that of Bcl-2 protein decreased with the increasing concentration of Syngrathus protein extract.ConclusionSyngrathus protein extract inhibits the proliferation and induces the apoptosis of Hela cells in vitro by up-regulating the expression of Bax and P53 and down-regulating the expression of Bcl-2. The apoptosis rate of Hela cells increases with the increasing concentration of Syngrathus protein extract.

syngrathus; protein extract; Hela cells; apoptosis

R 329

A

2095-5227(2014)06-0623-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.06.030

2013-11-05

劉宇欣，女，碩士。Email: yuxin19880610@163.com

李紅玉，女，教授，碩士生導(dǎo)師。Email: lihongyu@163. com