董周寰，呂亞莉，汪進良，鐘 梅，朱鳳偉，王 瓊，石懷銀

解放軍總醫(yī)院 病理科，北京 100853

激光顯微切割技術(shù)富集腫瘤細胞在基因突變檢測中的意義

董周寰，呂亞莉，汪進良，鐘 梅，朱鳳偉，王 瓊，石懷銀

解放軍總醫(yī)院 病理科，北京 100853

目的探討激光顯微切割技術(shù)富集腫瘤細胞對檢測非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變檢測的影響以及其臨床病理學意義。方法采用激光顯微切割技術(shù)富集49例NSCLC患者的石蠟包埋樣本的腫瘤細胞，采用PCR技術(shù)對EGFR基因第18、19、20、21號外顯子片段進行擴增后直接測序，分析其結(jié)果并比較其與常規(guī)腫瘤組織篩選后進行EGFR基因突變檢測結(jié)果的異同。結(jié)果49例NSCLC樣本中21例(42.9%)存在EGFR基因突變，包括第19號外顯子13例，第21號外顯子8例，沒有發(fā)現(xiàn)兩者同時突變的樣本。分析外顯子突變情況發(fā)現(xiàn)，利用激光顯微切割技術(shù)富集的樣本檢測突變率42.9%(21/49)，高于利用常規(guī)篩選后的突變率34.7%(17/49)，兩種方法的差異有統(tǒng)計學意義(P = 0.045 5＜0.05)。且比較兩種方法，可以發(fā)現(xiàn)前者檢測得到的突變峰峰高明顯高于后者。結(jié)論利用激光顯微切割技術(shù)富集腫瘤細胞能有效去除間質(zhì)細胞對腫瘤細胞的基因組干擾，更能體現(xiàn)腫瘤細胞基因組狀態(tài)，有效提高EGFR基因突變檢測檢出率，有利于患者靶向治療的臨床篩選。

激光顯微切割；非小細胞肺癌；表皮生長因子；突變

基因突變檢測表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變陽性的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者，酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)類藥物對其有效率＞70%而野生型＜5%，使用此類靶向藥物治療能有效延長患者的生存期[1]。目前常用的基因突變檢測方法如直接測序法、基于Realtime PCR的檢測法等[2]。直接測序法可以檢測所有的突變，但靈敏度不高；基于Real-time PCR基礎(chǔ)上的檢測方法靈敏度高，但只能檢測已知突變[3]。目前臨床送檢組織樣本60%為穿刺樣本，樣本中存在含量很高的間質(zhì)細胞、癌旁壞死細胞，使用常規(guī)腫瘤組織篩選(劃塊)很難去除。20世紀90年代中期發(fā)展起來的激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection，LCM)能夠快速準確地從復雜組織中分離均一的樣品組分，可在顯微鏡下準確捕捉腫瘤細胞，利用激光對捕捉區(qū)域進行切割，在不破壞細胞結(jié)構(gòu)、不改變組織的分子學特性的前提下富集復合組織中的腫瘤細胞，取得純凈的腫瘤細胞基因組進行突變檢測，基本剔除間質(zhì)及壞死細胞基因組對腫瘤細胞基因組的污染和稀釋，消除因?qū)嶒炦x用標本所造成的偏倚[4]。本實驗旨在比較常規(guī)腫瘤組織篩選方法與激光顯微切割技術(shù)篩選對穿刺樣本檢測結(jié)果的影響，進一步探索和建立更加快速準確的基因突變檢測方法，為進一步使用和規(guī)范該技術(shù)提供參考依據(jù)。

材料和方法

1 材料 收集本院2012年3 - 7月經(jīng)病理確診為NSCLC的穿刺組織石蠟包埋樣本49例，其中女性30例，男性19例，年齡46 ～ 79歲，中位年齡58歲，全部為腺癌樣本。同批次樣本在本次實驗前均已利用常規(guī)方法提取樣本基因組檢測EGFR基因突變并得到結(jié)果。

2 方法 切片：每例標本切取覆膜切片4張，厚度6 μm。切片前，切片臺用二甲苯和酒精擦拭，切片采用一次性切片刀，并用酒精清潔。切片時采用1個刀鋒對1個組織塊的方法，防止不同病例組織樣本間的交叉污染。染色：采用HE染色，并且對后續(xù)的擴增測序反應(yīng)基本無影響。富集腫瘤細胞：高年資病理科醫(yī)生在顯微鏡下對組織切片進行甄別，用儀器圈出所需腫瘤細胞，利用激光切割(圖1)進行收集。DNA提?。哼\用Qiagen公司的DNA提取純化試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)從石蠟組織中提取基因組DNA(具體操作步驟見試劑盒說明書)，將提取的基因組DNA用紫外分光光度儀測定樣本純度和濃度，A260/ A280為1.7 ～ 2.0，A260/A230＞1.7。PCR擴增：對所提取的樣本DNA的EGFR基因(18、19、20、21號外顯子)進行擴增。引物序列為：18號外顯子上游引物：5’-CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGT GTC-3’，下游引物：5’-GAGTTTCCCAAACACTC AGTGAAAC-3’；19號外顯子上游引物：5’-GCAAT ATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3’，下游引物：5’-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3’；20號外顯子上游引物：5’-CCATGAGTACGTATTTTGAAA CTC-3’，下游引物：5’-CATATCCCCATGGCAAA CTCTTGC-3’；21號外顯子上游引物：5’-CTAA CGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3’，下游引物：5’-G CTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3’。序列測定：對PCR擴增產(chǎn)物進行割膠純化，用ABI 3730XL測序儀進行雙向測序，得到序列峰圖后，利用Chromas軟件進行基因序列的突變分析。

3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩個樣本率之間差異比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 基因檢測總體情況 利用激光顯微切割技術(shù)富集腫瘤細胞提取基因組DNA，采用PCR技術(shù)擴增及直接測序法檢測的49例樣本中，總突變率為42.9%(21/49)，集中于19號外顯子以及21號外顯子，突變率分別為26.5%(13/49)和16.3%(8/49)，21號外顯子為L858R密碼子點突變，19號外顯子為第746 ～ 753位密碼子堿基缺失。未發(fā)現(xiàn)兩者同時突變的樣本。

圖 1 顯微激光切割收集樣本前后對比 A： 激光顯微切割前樣本；B： 激光顯微切割后樣本Fig. 1 Samples before laser microdissection (A) and after laser microdissection (B)

圖 2 直接測序法檢測樣本序列峰圖 A：常規(guī)方法收集樣本后直接測序法測序，19外顯子峰圖； B：激光顯微切割收集樣本后直接測序法測序，19外顯子峰圖； C：常規(guī)方法收集樣本后直接測序法測序，21外顯子峰圖； D：激光顯微切割收集樣本后直接測序法測序，21外顯子峰圖Fig. 2 Direct sequencing showing sequence peak in samples A: Direct sequencing showing exon 19 mutation peak in conventional sample; B: Direct sequencing showing exon 19 mutation peak after laser microdissection; C: Direct sequencing showing exon 21 mutation peak in conventional sample; D: Direct sequencing showing exon 21 mutation peak after laser microdissection

2 激光顯微切割與常規(guī)劃塊收集樣本檢測突變比較 利用激光顯微切割技術(shù)富集腫瘤細胞的突變率42.9%(21/49)高于同批次利用常規(guī)腫瘤組織篩選樣本的突變率34.7%(17/49)，兩種方法的差異有統(tǒng)計學意義(P = 0.045 5＜0.05)，一致性檢驗有統(tǒng)計學意義，Kappa = 0.829 3，一致率為91.8%。且前者得到的突變峰峰高明顯高于后者；在常規(guī)腫瘤組織篩選樣本的測序峰圖中無法判斷是否存在突變峰，但在激光顯微切割技術(shù)收集樣本的測序峰圖中，可以明確EGFR基因21號外顯子發(fā)生了點突變；常規(guī)腫瘤組織篩選樣本的測序峰圖主峰為EGFR基因19號外顯子正常序列峰圖，而激光顯微切割技術(shù)收集的測序峰圖的主峰卻為EGFR基因19號外顯子突變序列峰圖(圖2)。

討 論

EGFR基因的酪氨酸激酶編碼區(qū)突變，是NSCLC治療使用吉非替尼等TKI類靶向藥物的重要依據(jù)和預(yù)測指標[5]。最常見的突變位點包括19號外顯子堿基缺失導致受體ATP結(jié)合囊的角度的改變，以及21號外顯子的L858R突變導致的A-loop穩(wěn)定性提高，從而顯著增強癌細胞對吉非替尼以及厄洛替尼的敏感性[6-7]。

目前，臨床送檢EGFR樣本60%為穿刺樣本，文獻表明，活檢和穿刺標本的EGFR突變率比手術(shù)切除標本的突變率低[8-9]。研究顯示隨著樣本中腫瘤細胞含量的減少，EGFR突變檢出率有逐漸下降的趨勢。分析原因可能是因為檢測技術(shù)的靈敏度不高，以及取材局限，不能完全剔除間質(zhì)及壞死細胞對腫瘤細胞基因組的干擾，客觀上稀釋了突變細胞的含量，導致測序結(jié)果假陰性。

國外文獻報道，利用激光顯微切割技術(shù)進行腫瘤相關(guān)研究，用于分離腫瘤細胞和間質(zhì)細胞，進行癌細胞的基因表達和突變分析[10-12]。利用激光顯微切割技術(shù)，可將不同成分、不同數(shù)量的間質(zhì)細胞去除，獲得常規(guī)的病理取材很難取得的純凈的腫瘤細胞的DNA、RNA或者蛋白質(zhì)。

實驗表明，利用激光顯微切割技術(shù)收集樣本檢測出突變率42.9%(21/49)明顯高于同批次樣本常規(guī)腫瘤組織篩選后檢出的突變率34.7%(17/49)(P = 0.045 5＜0.05)。證實了樣本中的非腫瘤細胞的基因組對檢測存在干擾。而無論使用直接測序法還是基于優(yōu)化Real-time PCR技術(shù)的檢測方法均有局限性，或敏感性低，或不能檢測出非常見突變位點和未知突變類型[8,13]。利用激光顯微切割技術(shù)富集腫瘤細胞聯(lián)合直接測序的方法，在不破壞細胞結(jié)構(gòu)、不改變組織的分子學特性的前提下富集復合組織中的腫瘤細胞，取得相對純凈的基因組進行突變檢測，基本剔除間質(zhì)及壞死細胞基因組對腫瘤細胞基因組污染和稀釋。本實驗證明，使用激光顯微切割收集的腫瘤細胞，具有明顯的優(yōu)勢，能夠顯示腫瘤細胞基因組突變的實際情況，有效提高EGFR檢測的陽性檢出率。

根據(jù)本實驗獲得的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)利用激光顯微切割技術(shù)可以從選材精確富集腫瘤細胞，使檢測結(jié)果顯示為腫瘤細胞基因組的實際情況，精確定量腫瘤細胞的基因突變以及表達情況。臨床醫(yī)師根據(jù)檢測結(jié)果選擇治療方案時，可使患者能夠最大限度地獲益，值得在臨床病理科推廣。

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Significance of laser microdissection-enriched tumor cells in detection of gene mutation

DONG Zhou-huan, LYU Ya-li, WANG Jin-liang, ZHONG Mei, ZHU Feng-wei, WANG Qiong, SHI Huai-yin
Department of Pathology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Corresponding author: SHI Huai-yin. Email: shihuaiyin@sina.com

ObjectiveTo study the effect of laser microdissection-enriched tumor cells on detection of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation in non-small cell lung cancer (NSCLC) and its clinicopathological significance.MethodsParaffinembedded tumor cells from 49 NSCLC patients were enriched by laser microdissection. EGFR gene fragments from exon 18 to 21 were amplif i ed by PCR and sequenced. The EGFR gene mutations in NSCLC were compared with those in other cancers.ResultsOf the 49 NSCLC samples, 21 (42.9%) had EGFR gene mutations including exon 19 mutation in 13 and exon 21 mutation in 8. However, both exon 19 and exon 21 mutations were not detected. The analysis of exon mutations showed that the mutation rate was higher in laser microdissection-enriched samples than in conventional tumor tissue samples (42.9% vs 34.7%, P＜0.05). The mutation peak was significantly higher in the former than in the latter.ConclusionLaser microdissection-enriched tumor cells can effectively prevent the intervention of tumor cell genome against interstitial cells, ref l ect the status of tumor cells genome, effectively improve the detection rate of EGFR gene mutations, thus contributing to the clinical screening of target therapy for NSCLC patients.

laser microdissection; non-small cell lung cancer; epidermal growth factor; mutation

R 34-33

A

2095-5227(2014)06-0614-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.06.027

2014-03-07 10:56

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140307.1056.001.html

2014-01-07

國家自然科學基金項目(81202965)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81202965)

董周寰，男，技師。Email: dzh_8743@163.com

石懷銀，男，碩士，主任醫(yī)師。Email: shihuaiyin@sina. com