李春霞

(安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001)

蛭弧菌(Bdellovibrio)是一類寄生于其它細(xì)菌并導(dǎo)致其裂解的寄生性細(xì)菌［1］。蛭弧菌具有類似噬菌體的功能，對自然環(huán)境中的細(xì)菌具有很強(qiáng)的裂解作用，其與宿主間并沒有嚴(yán)格的特異性，有研究表明，蛭弧菌能裂解大多數(shù)科屬的革蘭氏陰性菌和少數(shù)革蘭氏陽性菌［2］，能對導(dǎo)致人類食物中毒和漁業(yè)養(yǎng)殖病害的致病菌具有良好的裂解清除效果，且對動植物無毒副作用［3］。

響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology)是解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，其首先進(jìn)行合理的試驗設(shè)計，通過實(shí)驗得到相應(yīng)數(shù)據(jù)，運(yùn)用多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的顯著分析來尋求最優(yōu)的條件參數(shù)［4］。應(yīng)用Design-Expert 軟件系統(tǒng)對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，擬合曲線，建立數(shù)學(xué)模型，檢驗?zāi)Ｐ偷暮线m性，利用三維立體圖形，觀察響應(yīng)曲面，尋求最佳組合條件［5］。

本文在研究影響蛭弧菌BD1 生長的pH、鹽度(NaCl)、二價金屬離子(Ca2+、Mg2+)和谷氨酸鈉4個單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法，以pH值、鹽度、二價金屬離子(Ca2+、Mg2+)和谷氨酸鈉為響應(yīng)因素，以菌體濃度的對數(shù)值為響應(yīng)值，用Design-Expert 6.0 的中心組合實(shí)驗設(shè)計(Central Composite Design，CCD)建立響應(yīng)曲面模型，優(yōu)化蛭弧菌BD1 的生長條件。

1 材料和方法

菌種:蛭弧菌BD1、宿主菌由本實(shí)驗室分離保存

培養(yǎng)基:DNB 雙層平板培養(yǎng)基等均按照參考文獻(xiàn)［6］配制。

1.1 宿主菌培養(yǎng)

宿主菌接種于滅菌的2216E 液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速為200(r·min-1)，溫度為28 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)14～15 h，使其處于對數(shù)生長期。

1.2 蛭弧菌的培養(yǎng)

將懸浮好的蛭弧菌與宿主菌以體積比2∶5 均勻混合并靜置30 min，取0.7 mL 混合液與3.5 mL 50 ℃的DNB 上層培養(yǎng)基均勻混合并傾注于DNB下層平板中。將DNB 雙層平板倒置于溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.3 實(shí)驗設(shè)計

中心組合實(shí)驗設(shè)計(Central Composite Design，CCD)是最常用的響應(yīng)面分析法，適用于2～5 個因素的優(yōu)化實(shí)驗。采用該法能夠在有限的試驗次數(shù)下，對因子及其交互作用進(jìn)行評價，而且還能對各因子進(jìn)行優(yōu)化，以獲得影響過程的最佳條件。根據(jù)中心組合實(shí)驗設(shè)計原理，本實(shí)驗選取對蛭弧菌的生長繁殖能力具有明顯影響的4 個因素，包括二價離子(Mg2+、Ca2+)(x1)、鹽度(x2)、谷氨酸鈉(x3)和pH(x4)，每個因素選取5 個水平，分別以-2，-1，0，1 和2 進(jìn)行編碼(見表1)，根據(jù)中心組合實(shí)驗設(shè)計(見表2)進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗，研究蛭弧菌的最佳培養(yǎng)條件，為蛭弧菌的發(fā)酵培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)。

表1 中心組合實(shí)驗中的變量及其水平

表2 中心組合實(shí)驗設(shè)計及其結(jié)果

1.4 培養(yǎng)方法

取30 個150 mL 的三角瓶，每瓶中精確地分裝50 mL 新配置的DNB 液體培養(yǎng)基，根據(jù)中心組合實(shí)驗設(shè)計(見表2)調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的pH、鹽度、谷氨酸鈉和Ca2+、Mg2+濃度，高壓滅菌后待用。向每瓶培養(yǎng)基中添加蛭弧菌和宿主菌，使其濃度分別達(dá)到2 ×102PFU/mL 和2 ×1010CFU/mL。在恒溫?fù)u床中(250 r·min-1)培養(yǎng)24 h，采用DNB 雙層平板法檢測瓶中蛭弧菌的濃度。中心組合實(shí)驗需進(jìn)行三次平行實(shí)驗以減少實(shí)驗誤差，實(shí)驗結(jié)果取平行實(shí)驗的平均值。

1.5 驗證實(shí)驗

以響應(yīng)面分析法得到的BD1 的最佳生長條件，做3 次平行實(shí)驗，驗證試驗結(jié)果。通過實(shí)驗結(jié)果與預(yù)測結(jié)果的相符性驗證響應(yīng)面分析方法的可靠性。

2 結(jié)果與分析

中心組合實(shí)驗結(jié)果如表2所示，經(jīng)Design Expert 6.0 軟件用標(biāo)準(zhǔn)多項式回歸法對實(shí)驗數(shù)據(jù)分析擬合后得到如下二次回歸方程

模型的方差分析結(jié)果如表3所示，在置信度水平α=0.01 時，該回歸模型極顯著，方程確定系數(shù)R2=0.9949，失擬項不顯著，說明對數(shù)據(jù)進(jìn)行很好的擬合，代表性較好，進(jìn)而可用該方程代替真實(shí)試驗點(diǎn)對結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。同時，變差系數(shù)CV=4.75%相對較低，說明整個試驗具有良好的精密度和可靠性。

模型回歸方程系數(shù)的顯著性檢測結(jié)果如表4所示，pH 對蛭弧菌生長活性有極顯著的影響(P＜0.0001)，谷氨酸鈉濃度、鹽度和二價金屬離子濃度則對蛭弧菌的生長繁殖能力具有顯著的影響(P＜0.05)。二次項(和)均極顯著，且交互項(x2x3和x3x4)顯著(P＜0.05)，說明各因素對響應(yīng)值的影響并不僅僅是簡單的線性關(guān)系，而是存在一定的交互作用，模型響應(yīng)面如圖1～圖6所示。

表3 二次多項模型方差分析表

表4 二次多項模型中回歸系數(shù)的估計值

圖1 鹽度與Ca2+、Mg2+間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖2 谷氨酸鈉與Ca2+、Mg2+間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖3 pH 值與Ca2+、Mg2+濃度間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖4 谷氨酸鈉與鹽度間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖5 pH 與鹽度間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

圖6 pH 與谷氨酸鈉間交互作用對蛭弧菌生長繁殖能力的影響曲面圖和等高線圖

等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩個因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩個因素交互作用顯著［7］。從圖1～圖6 可以直觀地看出，鹽度和二價金屬離子，谷氨酸鈉和二價金屬離子，谷氨酸鈉與鹽度交互作用不顯著;pH 與鹽度，pH 與谷氨酸鈉，pH 與二價金屬離子交互作用顯著。

模型優(yōu)化結(jié)果顯示，當(dāng)x1=-0.31，x2=-0.24，x3=-0.41，x4=0.38，即Ca2+、Mg2+濃度為6.38(mmol·L-1)，鹽度為2.88%，谷氨酸鈉濃度為4.18(mmol·L-1)，pH 為7.38 時，蛭弧菌的生長繁殖能力最強(qiáng)，此時模型預(yù)測蛭弧菌濃度對數(shù)值達(dá)到8.46。

為檢驗?zāi)Ｐ偷目煽啃?，采用上述?yōu)化條件培養(yǎng)蛭弧菌，考慮到實(shí)際操作的便利，將優(yōu)化條件修正為Ca2+、Mg2+濃度為6.4(mmol·L-1)，鹽度為2.9%，谷氨酸鈉濃度為4.2(mmol·L-1)，pH 為7.4，實(shí)際測得的蛭弧菌的濃度對數(shù)值為8.95，與理論預(yù)測值相對誤差為5.8%，因此通過該模型優(yōu)化得到的蛭弧菌BD1 的最佳培養(yǎng)條件準(zhǔn)確可靠，具有一定的理論價值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗采用響應(yīng)面分析方法，根據(jù)中心組合設(shè)計原理設(shè)計了四因素五水平實(shí)驗，采用Design-Expert 軟件處理實(shí)驗數(shù)據(jù)，得到了菌體生長模型，以及模型最優(yōu)時各因素的水平。實(shí)驗結(jié)果顯示:BD1 的最佳生長條件為:Ca2+、Mg2+濃度為6.4(mmol·L-1)，鹽度為2.9%，谷氨酸鈉濃度為4.2(mmol·L-1)，pH 為7.4。在該培養(yǎng)條件下，菌體生長模型達(dá)到顯著水平，模型可以對蛭弧菌BD1在不同條件下的生長情況進(jìn)行分析和預(yù)測，為蛭弧菌的培養(yǎng)和應(yīng)用提供理論參考。

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