羿麗杰，姜 宇，詹佳碩，閔鐘熳*

（1.沈陽師范大學糧食學院，遼寧 沈陽 110034；2.環(huán)境保護部核與輻射安全中心，北京 100082）

近年來，隨著經(jīng)濟全球化進程的加快，食品安全已成為當今世界性公共衛(wèi)生熱點。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌對人類健康造成極大危害，乳酸菌代謝產(chǎn)生的細菌素因具有抑菌、天然、安全的特性，而成為近年來研究的熱點。目前食品中使用的細菌素多為Ⅰ類細菌素，但是大多數(shù)乳酸菌菌株產(chǎn)生的細菌素抑菌譜較窄，且通常對引起食品腐敗的革蘭氏陰性菌不具有抑制作用，產(chǎn)生的量較少，且有些細菌素由質(zhì)粒編碼，產(chǎn)量不穩(wěn)定，理化性質(zhì)也不是很好。而本實驗所要研究的腸球菌素E3是屬于Ⅱ類乳酸菌細菌素，對大腸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和米曲霉具有抑制作用，而且它耐高溫，具有熱穩(wěn)定性[1]，因此是最有希望成為天然食品防腐劑的新型食品添加劑。

本試驗以東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中分離出的一株產(chǎn)細菌素的屎腸球菌菌株BC-3為研究對象，對其產(chǎn)生腸球菌素E3的發(fā)酵條件進行優(yōu)化[2]，并對腸球菌素E3的生物學性質(zhì)進行了研究[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌：屎腸球菌（Enterococcus faecium）BC-3 分離自北方傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜；指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）實驗室保存。

培養(yǎng)基[4]采用MRS培養(yǎng)基，溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設備

SW-CJ型超凈工作臺：上海愛明儀器有限公司；pH計：Thermo（MODEL868）美國科峻儀器公司；YXQ型電熱高壓蒸汽滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠；DHP-781恒溫培養(yǎng)箱：日本愛朗；Kendor離心機：美國科峻儀器公司；HZS-H型水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 抑菌效果測定

采用濾紙片法[5-6]，測量抑菌直徑，取3次試驗的平均值。其中抑菌圈直徑包括濾紙直徑（6 mm）。

1.3.2 單因素試驗[7-8]

發(fā)酵時間的影響：保持試驗過程中其他條件不變，發(fā)酵的時間為16 h、20 h、24 h、28 h，測定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

溫度的影響：保持試驗過程中其他條件不變，溫度為35 ℃、36 ℃、37 ℃、38 ℃，培養(yǎng)20 h，測定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

pH值的影響：保持試驗過程中其他條件不變，pH值為5、6、7、8，培養(yǎng)20 h，測定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

接種量的影響：保持試驗過程中其他條件不變，接種量為1%、2%、3%、4%，培養(yǎng)20 h，測定發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

1.3.3 正交試驗選擇初發(fā)酵最佳的條件

為了進一步確定最佳發(fā)酵條件，取4個影響因素：發(fā)酵時間、pH、接種量、溫度分別為A、B、C、D，各3個水平，制定因素水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization

1.3.4 腸球菌素生物學性質(zhì)的研究

（1）硫酸銨鹽析[9-10]

屎腸球菌BC-3發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min、4 ℃低溫離心10 min，取上清液棄菌體沉淀。取上清液用硫酸銨粉末進行鹽析，鹽析液裝于截留分子質(zhì)量為3 500 ku的透析袋中對去離子水透析脫鹽，用BaCl2跟蹤檢測去離子水中的硫酸根離子，沒有白色沉淀出現(xiàn)則透析完畢。透析后用液體用PEG20000濃縮至透析前體積，存放于4 ℃冰箱中待用。

（2）溫度對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

分別取等量的腸球菌素E3于EP管中，在60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃條件下水浴加熱10 min、20 min，然后測定其對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響。

（3）pH值對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

取等量的腸球菌素E3于EP管中，分別調(diào)pH值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，測定其對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響。

（4）蛋白酶對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

取等量的腸球菌素E3于5個EP管中，然后分別向試管中加入等量胃蛋白酶、胰蛋白酶，木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，空白，然后觀察抑菌活性。

（5）有機溶劑對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

取等量的腸球菌素E3于EP管中，分別加入乙醇、丙酮、乙醚、異丙醇，同體積原液為對照，測量抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間的影響

不同發(fā)酵時間對屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on enterococcin E3 yield

由圖1可知，發(fā)酵時間對抑菌活性影響較大，腸球菌素E3產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長而先增后降，當發(fā)酵時間為20 h時，抑菌活性達到最大，抑菌圈直徑為16.34 mm。

2.1.2 溫度的影響

不同的溫度對屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3的影響見圖2。

圖2 溫度對腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of temperature on enterococcin E3 yield

由圖2可知，溫度對抑菌活性影響較大，腸球菌素E3產(chǎn)量隨溫度升高而先增后降，在溫度為37 ℃時，抑菌活性達到最大，抑菌圈直徑達到最大為16.33 mm。

2.1.3 pH值的影響

不同的pH值對屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3影響見圖3。

圖3 pH值對腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH on enterococcin E3 yield

由圖3可知，腸球菌素E3產(chǎn)量隨pH的變化不是很明顯，隨pH增加抑菌活性先增后降，當pH值為6時，抑菌活性達到最大，此時抑菌圈直徑為16.24 mm。

2.1.4 接種量的影響

不同的接種量對屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3的影響見圖4。

圖4 接種量對腸球菌素E3產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of inoculum on enterococcin E3 yield

由圖4可知，腸球菌素E3產(chǎn)量隨接種量的增加而先增后降，當接種量為2%時，抑菌活性達到最大，此時抑菌圈的直徑為16.66 mm。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

通過單因素試驗確定，最佳溫度為37 ℃，最佳pH值為6，最佳接種量為2%，最佳發(fā)酵時間為20 h，為了進一步確定最佳發(fā)酵條件的組合，取4種影響因素：發(fā)酵時間、pH值、接種量、溫度，各因素取3個水平，采用L9（34）正交試驗設計[3]。正交試驗結(jié)果見表2。

通過極差分析表明，各因素的主次影響順序為：發(fā)酵時間＞溫度＞pH＞接種量，這表明發(fā)酵時間對屎腸球菌產(chǎn)腸球菌素E3量的影響最大，確定了屎腸球菌BC-3產(chǎn)腸球菌素E3的最佳發(fā)酵條件組合為A2B3C1D2。即在發(fā)酵時間為20 h、pH值為6.5、接種量為1.5%、溫度為37.0 ℃時抑菌效果最強，在此條件下的抑菌圈直徑為17.87 mm。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization

2.3 腸球菌素的生物學特性

2.3.1 溫度和時間對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

經(jīng)過硫酸銨鹽析后，得到腸球菌素E3粗提液，對其在不同溫度下的抑菌圈直徑進行測量，研究溫度和時間對腸球菌素E3穩(wěn)定性影響，結(jié)果見表3。

表3 溫度和時間對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of temperature and time on enterococcin E3 stability

由表3可知，道腸球菌素E3熱穩(wěn)定性較高，在120 ℃水浴加熱處理15 min后，抑菌活性仍能達到90%左右。

2.3.2 pH值對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

經(jīng)過硫酸銨鹽析后，得到腸球菌素粗提液，對其在不同pH值下的抑菌圈直徑進行測量，研究pH值對腸球菌素E3穩(wěn)定性影響，結(jié)果見表4。

表4 pH對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of pH on enterococcin E3 stability

由表4可知，腸球菌素E3在pH值2.0～10.0的范圍內(nèi)仍具有抑菌活性，且抑菌活性的變化不是很大，這說明pH值對腸球菌素E3穩(wěn)定性幾乎沒有影響。

2.3.3 蛋白酶對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

經(jīng)過硫酸銨鹽析后，得到腸球菌素E3粗提液，對其在經(jīng)不同蛋白酶處理下的抑菌圈直徑進行測量，研究蛋白酶對腸球菌素E3穩(wěn)定性影響，結(jié)果見表5。

表5 蛋白酶對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of protease on enterococcin E3 stability

由表5可知，腸球菌素E3經(jīng)各蛋白酶的作用，能夠完全失活，可確定這種抑菌活性的物質(zhì)為蛋白質(zhì)[11]，而且可被蛋白酶降解不會在機體內(nèi)殘留，具有較高的安全性[12]，這與岳喜慶等[13]曾經(jīng)的報道相似。

2.3.4 有機溶劑對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響

經(jīng)過硫酸銨鹽析后，得到腸球菌素E3粗提液，對其在不同有機溶劑處理下的抑菌圈直徑進行測量，研究有機溶劑對腸球菌素E3穩(wěn)定性影響，結(jié)果見表6。

表6 有機溶劑對腸球菌素E3穩(wěn)定性的影響Table 6 Effect of organic solvents on enterococcin E3 stability

由表6可知，腸球菌素E3經(jīng)有機溶劑作用后仍具有抑菌活性，因此有機溶劑作用對腸球菌素E3的影響不是很大，證明其化學性質(zhì)比較穩(wěn)定。

3 結(jié)論

為提高腸球菌素E3的產(chǎn)量，進行單因素試驗和正交試驗，得到在發(fā)酵時間為20 h、pH值為6.5、接種量為1.5%、溫度為37.0 ℃時抑菌活性最高，此時抑菌直徑為17.87 mm。對腸球菌素E3的生物學特性試驗分析得到，腸球菌素E3具有耐熱性，在pH為2.0～10.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，可以被蛋白酶完全降解，安全性高，有機溶液處理后其穩(wěn)定性幾乎不受影響。說明腸球菌素E3在食品防腐中具有很好的應用前景[14-15]，值得進一步深入研究。

[1]DRIDER D,FIMLAND G,HECHARD Y,et al.The continuing story of classⅡa bacteriocins[J].Microbiol Mol Biol Rev,2006,70(2):564-582.

[2]呂燕妮，李平蘭.戊糖乳桿菌31-1 菌株產(chǎn)細菌素發(fā)酵條件優(yōu)化[J].微生物學通報，2005，32（3）：13-19.

[3]張國強，師俊玲，楊自文.乳酸桿菌SD－22 產(chǎn)類細菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].中國食品學報，2009，9（1）：137-142.

[4]周德慶.微生物試驗學教程[M].北京：高等教育出版社，2002.

[5]田 宇，洪 芳，胡 承，等.類型菌素產(chǎn)生菌HF08 的選育及其發(fā)酵條件的研究[J].食品發(fā)酵工業(yè)，2004，30（3）：56-61.

[6]曾維才，譚 敏，張佳琪.不同抑菌方法在食品防腐劑效果評價方面的比較[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2010，27（3）：112-117.

[7]常 峰，易奎星，劉小蘭，等.類細菌素高產(chǎn)菌CF10 的篩選誘變及發(fā)酵條件的研究[J].食品科學，2006，27（1）：143-148.

[8]曾志剛，陳 英，余柏松，等.細菌素產(chǎn)生菌的篩選及其細菌素的分離純化[J].中國抗生素雜志，2003，28（5）：257-260.

[9]凌代文，東秀珠.乳酸菌分離鑒定及試驗方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1996.

[10]周 偉，李平蘭，周 康，等.溫度，pH 及鹽析對植物乳桿菌素L-1 作用單核細胞增生李斯特氏菌的影響[J].食品科學，2006，27（2）：121-126.

[11]LINE J E,SVETOCH E A,ERUSLANOV B V,et al.Isolation and purification of enterocin E-760 with broad antimicrobial activity against gram-positive and gram-negative bacteria[J].Antimicrob Agents Ch,2008,52(3):1094-1100.

[12]呂燕妮，李平蘭，孫成虎，等.戊糖乳桿菌31-1 菌株所產(chǎn)細菌素的理化及生物學特性[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報，2006，11（1）：39-43.

[13]岳喜慶，閔鐘熳，郭 晨，等.產(chǎn)Ⅱa 類細菌素乳酸菌的篩選及鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2011，27（2）：410-414.

[14]劉 毅.天然食品防腐劑抗菌肽[J].食品科學，1999，20（11）：18-21.

[15]AYMERICH M T,GARRIGA M,MONFORT J M,et al.Bacteriocin producingLactobacillusin Spanish style fermented sausages:characterization of bacteriocins[J].Food Microbiol,2000,17:33-45.