羅惠波，王 毅，邊名鴻，楊曉東，楊建勤

(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000;2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000;3.江安縣工業(yè)園區(qū)管理委員會，四川 江安 644200;4.成都新憶坊商貿(mào)有限公司，成都 610036)

糖化酶(Glucoamylase，EC 3.2.1.3.)是一種外切型糖苷酶，作為白酒微生物代謝過程主要代謝產(chǎn)物之一，其活力大小是衡量麩曲質(zhì)量的重要指標(biāo)［1-3］。糖化酶能按順序水解淀粉或淀粉類似物非還原端的多種糖苷鍵而生成葡萄糖［4］，因此被廣泛運(yùn)用于食品工業(yè)中。常規(guī)測定糖化酶活力方法有次碘酸鹽法、Schoorl法(DU法)、快速滴定法和3，5-二硝基水楊酸(DNS)法等，但各個(gè)測定方法均有一定的缺陷［5-8］。

本文采用微量連續(xù)流動(dòng)分析儀對DNS法進(jìn)行改進(jìn)，利用導(dǎo)管取樣，運(yùn)用分光光度計(jì)的原理，通過電腦軟件自動(dòng)檢測樣品含量［9-10］，并與次碘酸鹽法、快速滴定法進(jìn)行比較，以期建立檢測麩曲糖化酶活力準(zhǔn)確、實(shí)用、快速、簡便的新方法，并為麩曲生產(chǎn)的規(guī)范化提供數(shù)據(jù)與理論支持，更好的指導(dǎo)麩曲生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

材料:麩曲，由釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;糖化酶(酶活力100000 U/g)，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

試劑:MgSO4、KH2PO4、NaNO3、醋酸、醋酸鈉、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸(DNS)等均為分析純，購于成都科龍化工試劑廠。

儀器與設(shè)備:UV-2000紫外可見分光光度計(jì)(上海尤尼柯有限公司);連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀(Micro-CFA)(美國Astoria Pacific International);恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

稱取10 g 的麩皮，加水 8%(v/m)，KH2PO40.02 g，MgSO40.02 g，NaNO30.3 g，在250 mL 三角瓶中潤料2 h后，121℃滅菌30 min，趁熱搖散，冷卻至40℃左右，接入0.3%(m/m)麩曲，混合均勻，于溫度30℃、濕度95%，培養(yǎng) 48 h［11］(22 h 時(shí)進(jìn)行扣瓶)。

1.3 粗酶液的制備

發(fā)酵結(jié)束后，加入40℃水170 mL。然后加入20 mL pH4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，攪勻，40℃保溫浸泡1 h，保溫時(shí)每隔10 min攪拌1次。用脫脂棉過濾，棄去初濾液，得澄清濾液待用［11］(濾液應(yīng)盡快分析，若30 min內(nèi)不能使用，應(yīng)將濾液暫置冰箱中冷藏，分析時(shí)升溫至40℃后使用)。

1.4 檢測方法

1.4.1 酶活力測定方法

次碘酸鹽測定糖化酶活力［5］。

快速滴定法測定糖化酶活力［7］。

3，5-二硝基水楊酸法測定糖化酶活力［8］。

1.4.2 連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀檢測

在傳統(tǒng)3，5-二硝基水楊酸(DNS)法的基礎(chǔ)上，結(jié)合美國(API)連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀，對麩曲糖化酶和標(biāo)準(zhǔn)糖化酶活力進(jìn)行測定(圖1)。

圖1 糖化酶活力測定連接示意圖

1.4.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

濃縮標(biāo)準(zhǔn)液(10 g/L):稱取1 g葡萄糖溶于100 mL蒸餾水，需存于棕色瓶內(nèi)，4～6℃保存，備用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋:將濃縮標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋濃度見表1。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液

1.4.4 糖化酶酶液的制備

稱取1.1366 g糖化酶，溶于200 mL蒸餾水中，配得的糖化酶活力為568.3 U/mL，4～6℃保存，備用。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對不同方法測定的糖化酶活力與準(zhǔn)確度進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。結(jié)合F-檢驗(yàn)雙樣本方差分析，分析測定麩曲糖化酶活力的最佳方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法測定糖化酶活力

采用不同方法對糖化酶的活力進(jìn)行測定，通過t檢驗(yàn)分析結(jié)果見表2。

表2 不同方法測定糖化酶活力分析

由表2可知，采用不同方法測定糖化酶活力其準(zhǔn)確度有較大的差異。通過誤差和均值分析可知，次碘酸鹽的差值最小，說明次碘酸鹽有較高的準(zhǔn)確度;而DNS法的差值最大，準(zhǔn)確度最低。從RSD值也可以看出，次碘酸鹽法的RSD值為3.6%，較快速滴定法和DNS法準(zhǔn)確度高。

通過t檢驗(yàn)，采用次碘酸鹽法和DNS法測定糖化酶活力，t值分別為2.118 和2.317，均小于t(0.025，4)=2.776。雙尾概率分別為 0.102 和 0.081，均大于 0.05。所以采用次碘酸鹽法和DNS法測定糖化酶活力無顯著性的系統(tǒng)誤差。而采用快速滴定法測定糖化酶活力時(shí)，t=3.293 ＞ t(0.025，4)=2.776，雙尾概率 0.03 ＜0.05，說明采用快速滴定法測定糖化酶活力的結(jié)果有顯著性的系統(tǒng)誤差。

2.2 不同方法測定麩曲糖化酶活力

采用不同方法對麩曲糖化酶的活力進(jìn)行測定，通過F檢驗(yàn)分析結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果見表4。

表3 不同方法測定麩曲糖化酶活力分析

由表3可知，通過誤差分析，不同方法測定麩曲糖化酶活力有相對誤差，且次碘酸鹽法測定結(jié)果誤差值最小，RSD為3.7%?？焖俚味ǚê虳NS法測定的結(jié)果都有較大的誤差，影響的因素可能是測定結(jié)果的判定和操作引起的。

表4 不同方法測定糖化酶活力方差分析

由表4可知，通過F-檢驗(yàn)雙樣本方差分析，三種測定方法相互比較，其結(jié)果是P值均大于0.05，即三種測定結(jié)果的精密度沒有顯著性。

2.3 DNS法優(yōu)化探討

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

將梯度葡萄糖溶液通過連續(xù)化學(xué)分析儀進(jìn)行檢測，并利用一次曲線對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果圖2所示。

圖2 還原糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

將DNS法應(yīng)用到連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀中，進(jìn)行還原糖的測定，由圖2可知，采用DNS改進(jìn)法測定還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=0.001045x-0.028，R2=0.9997。所以，在還原糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度測定范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，符合檢測要求。

2.3.2 DNS優(yōu)化法測定糖化酶活力

采用DNS優(yōu)化法測定糖化酶活力，通過t檢驗(yàn)分析結(jié)果見表5。

表5 DNS優(yōu)化法測定糖化酶活力分析

由表5可知，通過t檢驗(yàn)，采用DNS優(yōu)化法測定糖化酶活力 t=1.806 ＜ t(0.025，4)=2.776，雙尾概率為0.145＞0.05，所以采用DNS優(yōu)化法測定無顯著性的系統(tǒng)誤差。

2.4 對比試驗(yàn)

對比次碘酸鹽法、快速滴定法和DNS改進(jìn)法測定麩曲糖化酶活力的結(jié)果見表6。DNS優(yōu)化法方差分析結(jié)果見表7。

表6 對比試驗(yàn)結(jié)果

表7 DNS優(yōu)化法方差分析結(jié)果

由表6可知，經(jīng)F-檢驗(yàn)雙樣本分析，采用DNS優(yōu)化法測定麩曲糖化酶活力，與快速滴定法和DNS法方差比較，P 值分別為 0.031 和 0.036，均小于 0.05;同時(shí) F值均小于1，即DNS優(yōu)化法較快速滴定法和DNS法精密度有顯著提高。DNS優(yōu)化法較次碘酸鹽法精密度沒有顯著性差異，但誤差減小。

3 結(jié)束語

通過t-檢驗(yàn)，采用次碘酸鹽法和DNS法測定糖化酶活力，t值分別為2.118 和2.317，均小于 t(0.025，4)=2.776，雙尾概率分別為 0.102 和0.081，均大于 0.05，所以采用次碘酸鹽法和DNS法測定糖化酶活力無顯著性的系統(tǒng)誤差。而采用快速滴定法測定糖化酶活力時(shí)，t=3.293 ＞ t(0.025，4)=2.776，雙尾概率 0.03 ＜0.05，說明采用快速滴定法測定糖化酶活力的結(jié)果有顯著性的系統(tǒng)誤差。通過t-檢驗(yàn)可知，采用DNS優(yōu)化法測定無顯著性系統(tǒng)誤差。

通過F-檢驗(yàn)雙樣本方差分析，采用次碘酸鹽法、快速滴定法和DNS法三者比較，其F-檢驗(yàn)的P值均大于0.05，即三種測定結(jié)果的精密度沒有顯著性。DNS優(yōu)化法與次碘酸鹽法、快速滴定法、DNS法進(jìn)行雙樣本方差分析，DNS優(yōu)化法與快速滴定法、DNS法比較，其精密度有顯著提高，而與次碘酸鹽法沒有顯著性差異。

改進(jìn)后的DNS法在操作上更加簡便、人為因素影響小，在處理樣品較多的時(shí)候優(yōu)勢明顯。同時(shí)，DNS改進(jìn)法為后續(xù)麩曲及麩曲釀造過程中糖化酶活力的分析檢測奠定了基礎(chǔ)。

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