趙慧 王遂 劉笑平 林永紅 王松波 宋雙林 李開(kāi)隆

摘要 ?[目的]通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)雜種楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的DNA序列、蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。[方法] 以XET基因及其氨基酸序列為研究對(duì)象，利用多種網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。[結(jié)果]該基因編碼290個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量33 672.0 D，理論等電點(diǎn)（pI）7.04;該酶可能存在3個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)部位、1個(gè)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)和1個(gè)跨膜區(qū)，是典型的分泌蛋白;三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模預(yù)測(cè)結(jié)果較好，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中的螺旋、卷曲和折疊均可見(jiàn)。相似性比對(duì)和進(jìn)化分析顯示其與葡萄等的序列相似度較高;而蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)則發(fā)現(xiàn)，該酶與幾種桿菌的蛋白較接近。[結(jié)論]XET基因可能在很多生物中具有較高的保守性。

關(guān)鍵詞 楊樹(shù);木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào) S792.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A ?文章編號(hào) 0517-6611（2014）34-12132-05

Bioinformatics Analysis of Populus alba × Populus tremula var. glandulosa Xyloglucan Endotransglycosylase （XET） Gene

ZHAO Hui1， WANG Sui1， LIU Xiaoping2， LI Kailong1* et al ?（1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040; 2. Jilin Linjiang Forestry Bureau， Linjiang， Jilin 134600 ）

Abstract ?[Objective] Analyze and predict the structure and feature of Populus alba × Populus tremula var. glandulosa xyloglucan endotransglycosylase （XET） gene/protein sequence through bioinformatics method， and pave the way for the downstream experiments. [Method] Utilize various online databases and bioinformatics software to predict XET gene and its corresponding protein. [Result] XET gene encodes 290 aa; protein molecular weight is 33 672.0 D， theoretical isoelectric point is 7.04; XET contains 3 coiled coils， 1 signal peptide and 1 transmembrane domain indicating that it is a typical secretory protein; prediction of secondary structure and homologous modeling of tertiary structure both returned rational results. [Conclusion] It is possible that XET gene possesses high conservation in different species.

Key words ?Populus alba × Populus tremula var. glandulosa; Xyloglucan endotransglycosylase; Bioinformatics

木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）是一類細(xì)胞壁松弛酶，屬于糖苷水解酶家族，在細(xì)胞伸長(zhǎng)過(guò)程中扮演重要角色[1]。研究表明，在細(xì)胞快速伸長(zhǎng)期伴有XET基因的表達(dá)，且XET的活性與細(xì)胞、組織的伸長(zhǎng)呈正相關(guān)。XET促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)是通過(guò)改變細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)引起的細(xì)胞壁松弛來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在該過(guò)程中木葡聚糖既是供體又是受體。首先，XET內(nèi)分解木葡聚糖多聚體，使纖維素纖維絲分離，改變木葡聚糖/微纖維絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛和細(xì)胞擴(kuò)展;隨后XET將新形成的還原末端連接到其他含非還原末端的木葡聚糖多聚體上，使細(xì)胞壁恢復(fù)其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[2]。近來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，XET在次生壁沉積的早期階段起作用，可能加強(qiáng)了初生和次生壁之間銜接[3]。因此，XET基因在細(xì)胞壁生物工程、植物生長(zhǎng)、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其物理特性改善等領(lǐng)域都有重要意義[4-5]。筆者通過(guò)較為全面的生物信息學(xué)分析方法對(duì)雜種楊樹(shù)（Populus alba × Populus tremula var. glandulosa）XET基因的DNA序列、RNA序列和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析，并對(duì)其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，以期為進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 所用材料楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因（XET）的NCBI登錄號(hào)為JX431932。

1.2 方法

使用NCBI中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)獲取核酸序列相關(guān)信息。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)使用ProtParam，酶切特性的預(yù)測(cè)使用DNAstar和BioEdit，親疏水性分析使用ProtScale軟件，信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用SignalP4.1在線軟件包，磷酸化和糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)使用NetPhos2.0和NetOGlyc3.1。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分別使用PredictProtein和PSIPRED v3.0 2種預(yù)測(cè)工具。三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)則使用SwissModel Workspace同源建模網(wǎng)絡(luò)綜合服務(wù)器。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast功能進(jìn)行序列相似性查詢，進(jìn)而通過(guò)ClustalX、DNAMAN和MEGA5.05進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 核酸序列分析。

利用該基因的登錄號(hào)，在Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并得到該基因的相關(guān)信息，結(jié)果顯示該基因的完整轉(zhuǎn)錄序列總長(zhǎng)1 141 bp，5UTR長(zhǎng)146 bp，3UTR長(zhǎng)122 bp，其CDS起始于ATG，終止于TAA，共873 bp，編碼290個(gè)氨基酸殘基。氨基酸序列見(jiàn)圖1。

圖1 氨基酸序列

2.1.2 氨基酸序列及蛋白質(zhì)特性分析。

通過(guò)ProtParam軟件，在線檢測(cè)楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)序列理化參數(shù)，得出XET氨基酸數(shù)目為290個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量33 672.0 D，理論等電點(diǎn)（pI）7.04。在整個(gè)氨基酸序列中，天門冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phe）含量最高，均為22個(gè)氨基酸，占總數(shù)的7.6%;而半胱氨酸（Cys） 含量最低，僅5個(gè)，占總數(shù)的1.7%。分子式為C1536H2262N402O431S13，脂肪系數(shù)（疏水值）為62.90，總平均親水性（GRAVY）為-0.450。

2.1.3 楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶酶切特性預(yù)測(cè)。

首先利用BioEdit分析該基因的限制性位點(diǎn)，進(jìn)而找到不能切割該蛋白的酶（圖2）。然后利用DNAstar軟件包中的Protean對(duì)該蛋白進(jìn)行模擬酶切預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 不能切割該序列的限制性內(nèi)切酶

圖3 蛋白酶酶切位點(diǎn)

2.1.4 楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶親疏水性分析。

利用ProtScale軟件來(lái)繪制楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶親疏水性列譜，以預(yù)測(cè)其折疊情況。使用Hphob./Kyte&Doolittle算法進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)僅存在1個(gè)高分值峰（分值>1.5），分布在10～20等域;而3個(gè)低分值（分值<0）的峰分別位于100～110、130～140、240～250氨基酸位點(diǎn)附近（圖4），預(yù)測(cè)該3個(gè)位置為蛋白質(zhì)的卷曲結(jié)構(gòu)部位。

2.1.5 楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

利用SignalP4.1在線軟件包對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽等的預(yù)測(cè)。物種選擇真核生物，其余使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，其中C值最高為0.667，出現(xiàn)在第20個(gè)氨基酸T上，Y值最高為0.801，同樣出現(xiàn)在第20個(gè)氨基酸T上（圖5），基于Ymax判定，楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶具有信號(hào)肽，，其最可能的剪切位點(diǎn)位于第19和第20位之間，是一個(gè)典型的分泌蛋白。

圖4 ProtScale親疏水性分析預(yù)測(cè)結(jié)果

圖5 SignalP信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

2.1.6 楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶氧糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

蛋白質(zhì)的糖基化是指在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)，和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過(guò)程。糖基化是對(duì)蛋白的重要的修飾作用，有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能作用。利用在線預(yù)測(cè)軟件NetOGlyc3.1對(duì)楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶氧糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，該酶沒(méi)有氧糖基化位點(diǎn)。

2.1.7 楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶激酶磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

蛋白質(zhì)磷酸化是指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸、絡(luò)氨酸）上的過(guò)程，是生物體內(nèi)一種普通的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中起重要作用。利用NetPhos2.0進(jìn)行在線的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶可能存在7個(gè)絲氨酸（Ser）、0個(gè)蘇氨酸（Thr）和5個(gè)絡(luò)氨酸（Tyr）的磷酸基化位點(diǎn)（圖6）。

圖6 NetPhos磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2014年

圖7 PSIPRED預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果

2.2 楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用PredictProtein預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，該蛋白是一個(gè)alphabeta混合型蛋白，其中螺旋（H）占8.62%，折疊（E）占34.14%，環(huán)（L）占57.24%。對(duì)其二硫鍵的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白沒(méi)有完整的二硫鍵。此外，對(duì)蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)含有氮糖基化、磷酸化和豆蔻酰化位點(diǎn)。

此外，通過(guò)PSIPRED平行進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。使用PSIPRED v3.0，通過(guò)PSIBLAST搜索同源序列進(jìn)而預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果與PredictProtein預(yù)測(cè)較相似（圖7）。

2.3 楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用SwissModel Workspace同源建模網(wǎng)絡(luò)綜合服務(wù)器對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用自動(dòng)方式（Automated Mode），得出蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型見(jiàn)圖8。對(duì)構(gòu)建好的模型進(jìn)行全局和局部的評(píng)估。全局法中QMEANscore4的得分為0.68，模型質(zhì)量較好。而局部法則顯示預(yù)測(cè)模型的健康度較好。而其序列相似性的比對(duì)結(jié)果顯示其與1umz_1（桿菌）極為相似。

2.4 楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶與其他物種的相似性比對(duì)以及進(jìn)化分析

2.4.1 核酸序列的Blast比對(duì)。

使用BlastP對(duì)其進(jìn)行氨基酸相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)除楊樹(shù)相關(guān)雜交種外，楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列還與美味獼猴桃（Actinidia deliciosa，AAC09388.1）、垂枝樺（Betula pendula，ABB72441.1）、柿樹(shù)（Diospyros kaki，AEQ37176.1）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002274520.1）、沙梨（Pyrus pyrifolia，CA02823.1）、蘋果（Malus ?domestica，N07897.1）、旱金蓮Tropaeolum majus，AAB39950.1）等的氨基酸序列相似性較高，相似度依次為93%、92%、91%、94%、90%、90%和85%。

2.4.2 多序列比對(duì)。

應(yīng)用ClustalX和DNAMAN將楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因所編碼的蛋白質(zhì)與美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）、垂枝樺（Betula pendula）、柿樹(shù)（Diospyros kaki）、葡萄（Vitis vinifera）、沙梨（Pyrus pyrifolia）、蘋果（Malus ?domestica）、旱金蓮（Tropaeolum majus）等XET相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)XET相關(guān)基因同源性很高（圖9）。

圖8 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4.3 基于進(jìn)化距離的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

繼續(xù)使用MEGA5對(duì)上述8種生物的進(jìn)化距離進(jìn)行估計(jì)，其中差異估算方法使用pdistance，得到的結(jié)果見(jiàn)圖10。

進(jìn)而使用MEGA5進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，使用NJ法，檢驗(yàn)方法選擇“Bootstrap method”，抽樣次數(shù)為500。進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖11。通過(guò)對(duì)XET比對(duì)發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)與葡萄等的親緣關(guān)系較近。

3 討論

通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的DNA序列、蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析，并對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼290個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量33 672.0 D，理論等電點(diǎn)（pI）7.04;蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析顯示該酶存在3個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)部位，第19和第20位氨基酸間存在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，有12個(gè)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)氮糖基化位點(diǎn)，存在1個(gè)跨膜區(qū)，無(wú)二硫鍵，是一個(gè)典型的分泌蛋白。對(duì)整個(gè)XET基因家族進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)

圖9 不同物種木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶多序列比對(duì)分析

圖10 兩兩序列間進(jìn)化距離

圖11 Bootstrap檢驗(yàn)過(guò)的一致樹(shù)

其大都具有相對(duì)保守的糖基化位點(diǎn)，其催化活性位點(diǎn)為

EIDFE[2]，而在楊樹(shù)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因亦發(fā)現(xiàn)了該片

段，位于110個(gè)氨基酸附近，從側(cè)面驗(yàn)證了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性;三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模預(yù)測(cè)結(jié)果較好，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中的螺旋、卷曲和折

疊均可見(jiàn)。對(duì)該酶的DNA序列進(jìn)行Blast，進(jìn)而構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)其與葡萄等的序列相似度較高;而蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)則發(fā)現(xiàn)，該酶與幾種桿菌的蛋白較接近，表明其結(jié)構(gòu)可能在很多生物中具有保守性。

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