吳曉慧等

摘 要 轉(zhuǎn)化酶抑制子調(diào)控轉(zhuǎn)化酶的活性，在植物的糖代謝過程中具有重要作用。為了研究木薯的轉(zhuǎn)化酶抑制子，本實(shí)驗(yàn)利用木薯基因組數(shù)據(jù)庫分析及RT-PCR方法，從木薯中分離了1個(gè)木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子MeINH3的cDNA序列。MeINH3序列長度為564 bp，包含 528 bp的完整開放閱讀框，編碼127個(gè)氨基酸，N端有16個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，4個(gè)保守的半胱氨酸殘基可形成兩個(gè)二硫橋。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，MeINH3蛋白定位于胞外。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，推測其可能抑制木薯細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性。

關(guān)鍵詞 木薯；轉(zhuǎn)化酶抑制子；基因克隆；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào) S533；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Invertase inhibitor controls the activity of invertase and plays a significant role in the sucrose metabolic processes in plants. An invertase inhibitor gene MeINH3 was isolated from cassava by cassava genome database analysis and RT-PCR. Analysis of the sequence indicated that the cDNA of MeINH3 was consisted of 564 bp with an open reading frame（ORF）of 528 bp encoding 127 amino acids. MeINH3 had a signal peptide including 16 amino acids at N terminus and four conserved cysteine residues forming two disulfide bridges. The subcellular localization prediction showed that MeINH3 protein was located extracellularly， suggesting that it may inhibit the activity of cassava cell wall invertase.

Key words Cassava； Invertase inhibitor； Gene cloning； Bioinformatics analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.010

木薯（Manihot esculenta Crantz）是一種富含淀粉的塊根作物，原產(chǎn)南美洲亞馬遜河盆地，是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的糧食與經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。木薯淀粉的合成及積累是由植物體內(nèi)一系列相關(guān)酶催化下完成的[2]。研究木薯淀粉合成過程中蔗糖代謝相關(guān)酶的活性變化，對高淀粉木薯新品種的選育具有非常重要的意義。在木薯葉片光合作用形成的蔗糖，經(jīng)過韌皮部運(yùn)輸、卸載進(jìn)入木薯塊根，轉(zhuǎn)化酶在這一生理過程中起著非常重要的作用[2-3]。轉(zhuǎn)化酶（Iinvertase）在植物體內(nèi)催化蔗糖分解成葡萄糖和果糖[4]，根據(jù)等電點(diǎn)、酶活的最適pH值、可溶性和亞細(xì)胞定位，可將轉(zhuǎn)化酶區(qū)分為三類：液泡轉(zhuǎn)化酶（Inv-V）、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（Inv-CW）和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（Inv-N）[5]。轉(zhuǎn)化酶參與了植物的韌皮部卸載[6]、抵御病原菌侵染[7]、逆境脅迫反應(yīng)[8]、器官的形態(tài)建成[9]等生理過程。轉(zhuǎn)化酶活性的調(diào)節(jié)包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和翻譯后調(diào)節(jié)[10]。轉(zhuǎn)化酶抑制子（invertase inhibitors，INH）與轉(zhuǎn)化酶特異結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)化酶活性，屬于翻譯后調(diào)節(jié)[10]。轉(zhuǎn)化酶抑制子基因由多基因家族編碼，擬南芥基因組中有40多個(gè)與轉(zhuǎn)化酶抑制子基因同源的序列[11]。轉(zhuǎn)化酶抑制子調(diào)節(jié)木薯轉(zhuǎn)化酶的活性，間接調(diào)節(jié)了碳水化合物的分配，因此研究木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子有助于闡明木薯淀粉積累機(jī)制。

1961年Schwimmer等[12]在研究馬鈴薯轉(zhuǎn)化酶的酶學(xué)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)了INH的存在。1998年Greiner等[13]首次從煙草懸浮細(xì)胞中克隆獲得INH的基因序列，其重組蛋白可以抑制轉(zhuǎn)化酶活性。成善漢[14]在馬鈴薯塊莖中表達(dá)煙草液泡轉(zhuǎn)化酶抑制子基因Ntinhh抑制了馬鈴薯液泡轉(zhuǎn)化酶的活性，最終降低馬鈴薯還原糖的含量。這表明通過調(diào)節(jié)INH的表達(dá)，控制轉(zhuǎn)化酶的活性，導(dǎo)致植物體內(nèi)蔗糖代謝的改變。目前已有兩個(gè)木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子基因MeINH1和MeINH2被克隆[15]，本實(shí)驗(yàn)克隆了木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子基因MeINH3，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子功能及其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的SC8木薯葉片為實(shí)驗(yàn)材料，種植于海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地，植后90 d采樣。

1.1.2 主要試劑 RNAplant plus Reagent植物總RNA提取試劑購自天根生化科技有限公司，TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0和DL 2 000 DNA Marker購自TaKaRa公司，DNA片段回收試劑盒和卡那霉素購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；pEASY-T1 Cloning Kit 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 木薯葉片總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用RNAplant plus Reagent植物總RNA提取試劑提取SC8木薯葉片總RNA，具體操作參照產(chǎn)品說明書；總RNA經(jīng)電泳檢測后，采用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，具體步驟參照試劑盒提供的操作方案進(jìn)行。

1.2.2 木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子基因的PCR擴(kuò)增及序列分析 根據(jù)美國木薯基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cassava）預(yù)測到一個(gè)木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子基因，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增MeINH3基因。

上游引物：5′-GCAGCTAGTGGTCATGGGAAA

GG-3′

下游引物：5′-GCTAACTCGAAATTGGGTATGT

GAAA-3′

以SC8木薯葉片的cDNA為模板，擴(kuò)增MeINH3基因，反應(yīng)體系為：TaKaRa Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）5 μL，dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，cDNA模板1 μL，加水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA片段回收試劑盒回收目的片段，連接pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取菌斑到含卡那霉素（100 μg/mL）的1.5 mL液體LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)（200 r/min）8 h，菌液PCR鑒定陽性克隆送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。采用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列分析及同源樹構(gòu)建；采用在線軟件對木薯轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）及信號(hào)肽分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。

1.2.3 MeINH3的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)預(yù)測 利 用 Swiss-Model服務(wù)器（http：//swissmodel.expasy.org）對木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子MeINH3蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)的進(jìn)行同源建模。模板為煙草細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（PDB： 2cj8）。采用Pymol 軟件顯示和分析木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子MeINH3的3D結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯葉片總RNA提取及MeINH3的RT-PCR擴(kuò)增

木薯葉片總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰完整，沒有降解，質(zhì)量較好，可用于后續(xù)的基因克隆實(shí)驗(yàn)（圖1）。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，利用基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得1條大小約600 bp的片段（圖2）。

2.2 MeINH3的生物信息學(xué)分析

RT-PCR擴(kuò)增片段測序結(jié)果表明，以特異引物擴(kuò)增獲得了一段564 bp的cDNA序列，其中包含一段528 bp的開放閱讀框，編碼127個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，推斷的分子質(zhì)量為18.91 ku。MeINH3編碼的氨基酸序列與本實(shí)驗(yàn)室已克隆的兩個(gè)轉(zhuǎn)化酶抑制子（MeINH1和MeINH2）的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，它們氨基酸相似性在36%～61%之間，并且都具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基位點(diǎn)，第一個(gè)殘基和第二個(gè)殘基可形成一個(gè)二硫橋，第三個(gè)殘基和第四個(gè)殘基形成另一個(gè)二硫橋，這兩個(gè)二硫橋的存在，對MeINH的功能形成是必要的（圖3）。利用在線軟件Swiss-Model serve（http：//swissmodel.expasy.org）進(jìn)行MeINH3的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果表明，MeINH3由5個(gè)β螺旋（N端兩個(gè)β螺旋較小，C端β螺旋較大）和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，4個(gè)半胱氨酸殘基可形成兩個(gè)二硫橋（Cys31與Cys40，Cys99與Cys140）（圖4）。

3個(gè)木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子在N端都含有一段信號(hào)肽，MeINH1和MeINH2的信號(hào)肽分裂位點(diǎn)位于VQS和DAN之間，MeINH3的信號(hào)肽長度為16個(gè)氨基酸殘基，分裂位點(diǎn)位于VHA和AIP之間（圖3、5）。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，MeINH3定位于細(xì)胞外，預(yù)測得分為0.772（表1）。

木薯（Manihot esculenta Crantz）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、咖啡（Coffea canephora）、煙草（Nicotiana tabacum）、香瓜（Cucumis melo）、玉米（Zea mays）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、番茄（Solanum lycopersicum）和野草莓（Fragaria vesca）轉(zhuǎn)化酶抑制子的氨基酸序列比對及蛋白的系統(tǒng)樹分析結(jié)果表明，不同的基因編碼的INH同源性較低（圖6），相似性在12.7%～61%之間。MeINH1和MeINH2在一個(gè)進(jìn)化分支上，與擬南芥的AtCVIF1親緣關(guān)系最近，氨基酸序列相似性分別為40.1%和42.6%；MeINH3在另一進(jìn)化分支，與玉米的ZmINH親緣關(guān)系最近，氨基酸序列相似性為17.14%。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)克隆獲得的MeINH3的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為18.91 ku，這一結(jié)果與植物INH蛋白分子質(zhì)量（16～20 ku）相符[16]。有研究結(jié)果表明，植物INH蛋白的4個(gè)保守半胱氨酸殘基可分別形成兩個(gè)二硫橋，使蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并具有活性[10]。本實(shí)驗(yàn)室獲得的3個(gè)木薯INH基因編碼的蛋白質(zhì)中都具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基。MeINH3的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)建模預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，Cys31與Cys40，Cys99與Cys140可分別形成兩個(gè)二硫橋。這表明，二硫橋?qū)eINH3的蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要作用。植物INH蛋白的N端均具有一段信號(hào)肽序列，以利于蛋白質(zhì)的運(yùn)輸[10]。木薯的3個(gè)INH蛋白（MeINH1-3）的N端同樣具有一段信號(hào)肽序列，其中MeINH3的信號(hào)肽最短（16個(gè)氨基酸殘基），分裂位點(diǎn)位于VHA和AIP之間。系統(tǒng)樹分析結(jié)果表明，MeINH3與MeINH1、MeINH2的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與玉米的ZmINH親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，MeINH3定位于細(xì)胞外。根據(jù)以上生物信息學(xué)分析結(jié)構(gòu)，可推測MeINH3可調(diào)控細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶的活性。

INH是多基因編碼的蛋白，家族成員的序列保守性較差[17]，對3個(gè)木薯INH氨基酸序列比對及與其他物種的進(jìn)化樹分析也證明了家族成員的序列保守性較差（氨基酸相似性在36%～61%之間）。INH與果膠甲酯酶抑制子PMEI的序列較為相似，INH或PMEIs同源的基因都稱為果膠甲酯酶相關(guān)蛋白序列（PMEI-RPs）[12]。只通過序列分析還無法區(qū)分INH和PMEI[10]，所以克隆獲得的3個(gè)序列（MeINH1-3）還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，表達(dá)重組蛋白驗(yàn)證MeINH1-3是否真正抑制木薯轉(zhuǎn)化酶活性。本研究對木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子基因MeINH3進(jìn)行了克隆及行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究木薯轉(zhuǎn)化酶抑制子功能及其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Rolland-Sabaté A， Sánchez T， Buléon A， et al. Structural characterization of novel cassava starches with low and high-amylose contents in comparison with other commercial sources[J]. Food Hydrocolloids， 2012， 27（1）： 161-174.

[2] Jansson C， Westerbergh A， Zhang J M， et al. Cassava， a potential biofuel crop in（the）People's Republic of China[J]. Applied Energy， 2009， 86： S95-S99.

[3] Sojikul P， Kongsawadworakul P， ViboonjunU， et al. AFLP-based transcript profiling for cassava genome-wide expression analysis in the onset of storage root formation[J]. Physiologia plantarum， 2010， 140（2）： 189-298.

[4] Li Z， Palmer W M， Martin A P， et al. High invertase activity in tomato reproductive organs correlates with enhanced sucrose import into， and heat tolerance of， young fruit[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（3）： 1 155-1 166.

[5] RoitschT， Balibrea M E， Hofmann M， et al. Extracellular invertase： key metabolic enzyme and PR protein[J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54（382）： 513-524.

[6] Ruan Y L， Jin Y， Yang Y J， et al. Sugar Input， Metabolism， and Signaling Mediated by Invertase： Roles in Development， Yield Potential， and Response to Drought and Heat[J]. Molecular plant， 2010， 3（6）： 942.

[7] Siemens J， GonzáLez M C， Wolf S， et al. Extracellular invertase is involved in the regulation of clubroot disease in Arabidopsis thaliana[J]. Molecular plant pathology， 2011， 12（3）： 247-262.

[8] Misi D， Dragi evi M， Siler B， et al. Sugars and acid invertase mediate the physiological response of Schenkia spicata root cultures to salt stress[J]. Journal of plant physiology， 2012， 169： 1 281-1 289.

[9] Tang G Q， Luscher M， Sturm A， et al. Antisense repression of vacuolar and cell wall invertase in transgenic carrot alters early plant development and sucrose partitioning[J]. The Plant Cell， 1999， 11（2）： 177-189.

[10] Rausch T， Greiner S. Plant protein inhibitors of invertases[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2004， 1696（2）： 253-261.

[11] 劉 勛. 馬鈴薯轉(zhuǎn)化酶及其抑制子基因家族分析及與低溫糖化關(guān)系研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.

[12] Schwimmer S， Makower R U， Rorem E S. Invertase & invertase inhibitor in potato[J]. Plant physiology， 1961， 36（3）： 313.

[13] Greiner S， KrausgrillS， Rausch T. Cloning of a tobacco apoplasmic invertase inhibitor proof of function of the recombinant protein and expression analysis during plant development[J]. Plant physiology， 1998， 116（2）： 733-742.

[14] 成善漢. 馬鈴薯塊莖低溫糖化機(jī)理及轉(zhuǎn)化酶抑制子基因的克隆與功能鑒定[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2005.

[15] Geng M， Yao Y， Wu XH， et al. Cloning and Sequence Analysis of Two Cdna Encoding Invertase Inhibitors from Cassava（Manihot esculenta Crantz）[J]. Advanced materials research， 2013， 726-731： 4 326-4 329.

[16] Bonfig K B， Gabler A， Simon U K， et al. Post-translational derepression of invertase activity in source leaves via down-regulation of invertase inhibitor expression is part of the plant defense response[J]. Molecular plant， 2010， 3（6）： 1 037-1 048.

[17] Huang G J， Sheu M J， Chang Y S， et al. Isolation and characterisation of invertase inhibitor from sweet potato storage roots[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2008， 88（15）： 2 615-2 621.