周延清　張喻　李靜云　等

摘要：根據(jù)以前克隆的地黃RghBNG基因堿基序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，采用hiTAIL-PCR技術(shù)從懷地黃基因組DNA中擴(kuò)增出578 bp DNA片段。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，它與根癌土壤桿菌、土壤桿菌的纖維素合酶基因的同源性達(dá)81%～91%；它所含的453 bp的開放閱讀框（ORF）編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與根癌土壤桿菌、土壤桿菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌纖維素合酶基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性高達(dá)83%～99%，說明蛋白質(zhì)可能具有纖維素合酶的結(jié)構(gòu)域。用hiTAIL-PCR技術(shù)克隆懷地黃纖維素合酶基因，為進(jìn)一步研究其分子作用機(jī)制和在地黃分子育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：懷地黃；纖維素合酶；hiTAIL-PCR技術(shù)；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S567.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0021-03

收稿日期：2014-03-27

基金項(xiàng)目：河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（編號：092300410009）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號：14B180028）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號：201310476102）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（編號：13IRTSTHN009）。

作者簡介：周延清（1963—），男，河南鄧州人，博士，教授，主要從事遺傳學(xué)教學(xué)與研究。E-mail：yqzhou@htu.cn。地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄參科（Scrophulariaceae）地黃屬（Rehmannia）多年生草本植物，共有6個種，廣泛分布于中國、韓國和日本等地[1]。地黃在河南、山東、山西、陜西等省廣泛分布，為我國大宗常用中藥材之一，傳統(tǒng)認(rèn)為懷慶地黃[稱為懷地黃（R. glutinosa f.hueichingensis）]質(zhì)量優(yōu)良[2]。地黃塊根入藥，富含梓醇、糖類和苷類物質(zhì)、維生素、多種氨基酸、多種微量元素，具有防癌、抗癌、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、增強(qiáng)造血能力、降低血糖、防治糖尿病并發(fā)癥等功能[3]和重要的經(jīng)濟(jì)價值[4]。在方劑中，地黃的使用量占了很大的比重，例如六味地黃丸、知柏地黃丸和杞菊地黃丸等。 在保健使用方面，已經(jīng)開發(fā)出一些含有地黃成分的產(chǎn)品，如地黃精、地黃茶和地黃醋等[5]。國內(nèi)外關(guān)于地黃基因克隆、功能分析和表達(dá)模式研究已有報(bào)道。例如，用RT-PCR方法擴(kuò)增的地黃肌動蛋白基因片段，可用作內(nèi)參基因[6]；通過RT-qPCR分析地黃中11個內(nèi)參基因的mRNA表達(dá)差異情況[7]；用SSH方法克隆地黃塊根中RgPR-10 基因，研究其在地黃根和莖以及原核表達(dá)情況[3，8]；利用Solexa測序技術(shù)、生物信息學(xué)和熒光定量 PCR 分析從正茬地黃和重茬地黃中鑒定出89個miRNAs，預(yù)測其中 7個新型 miRNAs的15個靶基因，在正茬地黃和重茬地黃之間構(gòu)建miRNAs 差異表達(dá)譜[4，9]；進(jìn)行地黃赤霉素、脫落酸和部分寡糖合成代謝關(guān)鍵酶基因以及擴(kuò)展蛋白基因RgExpA1的克隆與表達(dá)分析[10-11]；用 PCR 技術(shù)克隆懷地黃轉(zhuǎn)座酶基因[12]；此外，還進(jìn)行了懷地黃RgVP和RgKAT基因的克隆和時空表達(dá)分析[13]及懷地黃3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和時空表達(dá)分析[14]。但尚未見克隆地黃纖維素合酶基因的報(bào)道，纖維素合成酶是將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖的一組復(fù)雜酶系的總稱[15-16]。迄今為止，已有從毛竹[17]和苧麻[18]等植物中克隆纖維素合酶基因的報(bào)道。本研究根據(jù)以前克隆的地黃RghBNG基因堿基序列[19]，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，采用hiTAIL-PCR技術(shù)[20]克隆懷地黃纖維素合酶基因序列，用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究其分子作用機(jī)制和在地黃分子育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

懷地黃85-5種植于河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)田，取其新鮮塊根用于提取DNA。

大腸桿菌DH5α菌株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，DNA凝膠回收試劑盒（上海生工服務(wù)有限公司）、Taq DNA聚合酶和DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）及克隆載體pMD19-T （TaKaRa 公司），引物合成和基因測序分別由北京華大基因有限公司和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1懷地黃基因組DNA的提取用CTAB法提取懷地黃基因組DNA，用紫外分析法和瓊脂糖凝膠電泳方法檢測基因組DNA的濃度、大小和純度。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究克隆的地黃RghBNG基因堿基序列（登錄號為JX290370），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3條下游特異引物，上游非特異性引物序列參見文獻(xiàn)[20]（表1）。

1.2.3hiTAIL-PCR反應(yīng)及檢測根據(jù)Liu等的hiTAIL-PCR程序[20]略作改進(jìn)。以懷地黃基因組DNA為模板，RH1分別與LAD1～LAD4配對，進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng)，其反應(yīng)液組分見表2，程序如下：93 ℃熱啟動2 min；95 ℃預(yù)變性 1 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，10個

表1所用引物名稱及其序列

引物名稱引物序列（5′→

反應(yīng)成分用量（μL）第1輪第2輪第3輪 模板1.01.01.0dNTP預(yù)混物（各2.5 mmol/L）4.0 4.02.010×LA PCR緩沖液（加入Mg2+） 2.02.5 2.5TaKaRa公司的5 U/μL LA Taq 0.50.6 0.5100 pmol/μL上游引物1.0 0.30.610 pmol/μL下游引物 0.3 0.3 0.6水 11.2 16.3 17.8

1.2.4基因片段的克隆、測序按照TaKaRa公司的載體pMD19-T說明書，將回收的目的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，連接液為5 μL，載體為0.5 μL，回收DNA的量為4.5 μL，共10 μL，16 ℃連接過夜。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取細(xì)胞懸浮液涂布于含氨芐青霉素Amp的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取菌落，進(jìn)行PCR檢測。將檢測為陽性的克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.5基因片段的生物信息學(xué)分析在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上運(yùn)用BLAST軟件進(jìn)行目的基因的同源性搜索，并進(jìn)行同源性比較。用MEGA 5的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[15]。通過 NCBI 網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測氨基酸的保守域[14]。

2結(jié)果與分析

2.1地黃基因組DNA片段的擴(kuò)增與電泳

用CTAB法提取懷地黃基因組DNA，經(jīng)紫外分光度法和瓊脂糖凝膠電泳方法分析符合后續(xù)試驗(yàn)要求后，用作模板，進(jìn)行hiTAIL-PCR，共擴(kuò)增出3個條帶（圖1）。

2.2地黃基因組DNA片段的回收、克隆與測序

用試劑盒回收圖1中B片段，克隆至載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆測序，測序結(jié)果顯示B片段長578 bp（圖1）。

2.3地黃類纖維素合酶基因的ORF及其編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列分析

利用 ORF Finder 分析B片段測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其含有453 bp 開放閱讀框，編碼151個氨基酸（圖2）。預(yù)測其編碼蛋白質(zhì)分子量約為18 ku，等電點(diǎn)為9.00，摩爾消光系數(shù)為34 045，不穩(wěn)定系數(shù)為49.51，為略堿性的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.4多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將測序所得的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)與已知10個物種的纖維素合酶基因及其編碼的氨基酸序列高度同源（表3）。用軟件MEGA 5構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）表明，其與根癌土壤桿菌和土壤桿菌的親緣關(guān)系最近。

2.5氨基酸保守域的預(yù)測

在NCBI 網(wǎng)站預(yù)測該氨基酸的保守域，發(fā)現(xiàn)其含有纖維表3地黃與其他物種纖維素合酶的同源性比較

物種GenBank登錄號氨基酸同源性

（%）核苷酸同源性

（%）根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）WP_003506371.19991土壤桿菌（Agrobacterium sp.）WP_020011862.19991菜豆根瘤菌（Rhizobium phaseoli）WP_016734164.188—豌豆根瘤菌（R. leguminosarum）WP_003578482.188—三葉草根瘤菌（R. leguminosarum bv.trifolii） YP_002975124.187—費(fèi)氏中華根瘤菌（Sinorhizobium fredii）YP_005192181.186 —苜蓿中華根瘤菌（S. meliloti）YP_007193525.185 —中華根瘤菌（S. medicae）WP_018010495.184 —

素合酶催化亞單位（UDP-forming）的保守域（圖4）。

3結(jié)論與討論

本研究根據(jù)以前克隆的地黃RghBNG基因堿基序列[19]，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，采用hiTAIL-PCR技術(shù)從懷地黃基因組DNA中擴(kuò)增出A、B、C 等3條帶，分別對其進(jìn)行回收、克隆、測序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B帶大小為578 bp，含有453 bp的開放閱讀框，編碼151個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)（另外2條帶A和C的分析結(jié)果在此未呈現(xiàn)）。它與根癌土壤桿菌、土壤桿菌的纖維素合酶基因的同源性達(dá)81%～91%，其編碼的氨基酸序列與根癌土壤桿菌、土壤桿菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌等纖維素合酶基因編

碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列同源性達(dá)83%～99%，而且其編碼的蛋白質(zhì)具有纖維素合成酶的結(jié)構(gòu)域。本研究首次從懷地黃中分離克隆了纖維素合酶基因，為研究其在地黃生長發(fā)育過程中的作用和地黃基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。該懷地黃DNA片段與其他植物纖維素合酶基因不同源，但與根瘤菌纖維素合成酶基因同源，可能是因?yàn)榈攸S生長發(fā)育過程中地黃塊根與其根際根瘤菌共生而發(fā)生后者基因組DNA片段轉(zhuǎn)移并整合到地黃基因組DNA中。但是，其具體形成原因有待進(jìn)一步深入研究。

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