權英存　劉虎守

摘要[目的] 研制兔病毒性出血癥新型疫苗。[方法]分別以黃芪多糖、蜂膠、鋁膠、生理鹽水為佐劑，研制兔病毒性出血癥黃芪多糖佐劑、蜂膠佐劑、鋁膠佐劑以及常規(guī)滅活疫苗，并從安全、免疫效果等方面對這4種疫苗進行比較。[結果] 4種疫苗均有良好的安全性。免疫后7 d 4種疫苗產生的特異性抗體效價均逐步升高，攻毒保護率均達到100%。免疫后14 d黃芪多糖佐劑抗體效價顯著高于蜂膠佐劑、鋁膠佐劑以及常規(guī)滅活疫苗。免疫后180 d黃芪多糖佐劑疫苗的保護率達75%，蜂膠佐劑與鋁膠佐劑可達到50%，常規(guī)滅活疫苗的保護率達25%。[結論] 這4種疫苗均具有良好的安全性和免疫原性，其中黃芪多糖滅活苗的免疫效果最好。

關鍵詞兔病毒性出血癥；黃芪多糖；蜂膠；鋁膠；滅活疫苗；免疫效果

中圖分類號S829.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03573-03

基金項目青海省大通縣農技推廣補助項目。

作者簡介權英存（1983- ），女，青海大通人，助理獸醫(yī)師，從事動物醫(yī)學方面的研究。

兔病毒性出血癥（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗稱兔瘟，是由兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起兔的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病[1-2]，該疾病傳播速度快、發(fā)病率和死亡率均較高，兔群一旦感染該病，將造成毀滅性災難，是危害養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展的頭號殺手[3]。該病首次爆發(fā)于我國江蘇地區(qū)[4]，現(xiàn)已呈世界范圍內流行，給全球的養(yǎng)兔業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[5-7]。目前，國內對該病的防控主要使用常規(guī)滅活疫苗進行免疫接種，隨著對動物免疫增強劑研究的不斷深入，黃芪多糖、蜂膠等具有抗菌、消炎、增強機體免疫功能等生物學功能的純天然藥物不斷得到開發(fā)和應用[8-11]。筆者用黃芪多糖和蜂膠作為疫苗佐劑，制備RHDV滅活疫苗，并比較RHDV黃芪多糖佐劑、蜂膠佐劑、鋁膠佐劑以及常規(guī)滅活疫苗的免疫效果，以期為黃芪多糖和蜂膠在動物疫苗佐劑中的開發(fā)和應用奠定基礎，為RHDV新型疫苗的研制開發(fā)和應用提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1病毒與試驗兔兔病毒性出血癥病毒（組織毒）由青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院實驗室分離并保存；未免疫過兔病毒性出血癥病毒疫苗的健康易感兔購自青海民和綠之苑兔業(yè)有限公司下屬養(yǎng)殖場。

1.2佐劑黃芪多糖購自西安康威生物工程有限公司；蜂膠購自青海門源蜂產品公司。

1.3兔病毒性出血癥病毒滅活抗原的制備與檢驗

1.3.1滅活抗原的制備。將兔病毒性出血癥病毒（組織毒）與滅菌生理鹽水（質量體積比約為1∶4）充分研磨搗碎，經(jīng)頸部皮下注射2月齡健康易感兔，每只注射2 ml，無菌取攻毒后24～72 h死亡兔的肝臟組織與滅菌生理鹽水（質量體積比約為1∶4）充分研磨搗碎，經(jīng)甲醛滅活后，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2滅活抗原的檢驗。按照《中華人民共和國獸藥典》三部2010年版中的方法分別進行滅活抗原對人“O”型紅細胞凝集效價的測定和細菌、霉菌、支原體的檢測。

1.44種佐劑兔病毒性出血癥滅活疫苗的制備

1.4.1蜂膠佐劑滅活疫苗的制備。將蜂膠碾碎過20目藥篩后，與無水乙醇（質量體積比約為1∶4）充分混合，置于37 ℃下作用48 h，取上清液即為純化的蜂膠乙醇浸液。將兔病毒性出血癥滅活抗原與蜂膠乙醇浸液按等體積充分混合，加入硫柳汞（占總體積的0.01%），即為兔病毒性出血癥蜂膠佐劑滅活疫苗。

1.4.2黃芪多糖佐劑滅活疫苗的制備。將黃芪多糖用蒸餾水配制成濃度25 mg/ml的溶液，高壓蒸汽滅菌，即得黃芪多糖佐劑。將兔病毒性出血癥滅活抗原與黃芪多糖佐劑按等體積充分混合，加入硫柳汞（占總體積的0.01%），即為兔病毒性出血癥黃芪多糖佐劑滅活疫苗。

1.4.3鋁膠佐劑滅活疫苗的制備。將三氯化鋁用蒸餾水配制成8%的溶液，加溫至56～60 ℃，用氫氧化鈉溶液緩慢調節(jié)pH至5.6～6.0，高壓蒸汽滅菌，即得鋁膠佐劑。將兔病毒性出血癥滅活抗原與鋁膠佐劑按等體積充分混合，加入硫柳汞（占總體積的0.01%），即為兔病毒性出血癥鋁膠佐劑滅活疫苗。

1.4.4常規(guī)滅活疫苗的制備。將兔病毒性出血癥滅活抗原與滅菌生理鹽水等體積充分混合，加入硫柳汞（占總體積的0.01%），即為兔病毒性出血癥常規(guī)滅活疫苗。

1.54種疫苗的物理性狀檢驗按照《中華人民共和國獸藥典》三部2010年版中的方法分別進行兔病毒性出血癥蜂膠佐劑、黃芪多糖佐劑、鋁膠佐劑、生理鹽水佐劑滅活疫苗的劑型、穩(wěn)定性等物理性狀檢驗。

1.64種疫苗的無菌檢驗按照《中華人民共和國獸藥典》三部2010年版中的方法分別進行兔病毒性出血癥蜂膠佐劑、黃芪多糖佐劑、鋁膠佐劑、生理鹽水佐劑滅活疫苗的細菌、霉菌、支原體的檢測。

1.74種疫苗的安全性檢驗分別將兔病毒性出血癥蜂膠佐劑、黃芪多糖佐劑、鋁膠佐劑、生理鹽水佐劑滅活疫苗經(jīng)頸部皮下各注射健康易感兔10只，注射劑量為4 ml/只，觀察10 d，免疫兔應無任何不良反應。

1.84種疫苗的效力檢驗

1.8.1試驗設計與分組。將120只健康易感家兔隨機分為5組（對照組、試驗I組、試驗II組、試驗III組、試驗IV組），每組24只。試驗I組、II組、III組、IV組分別免疫兔病毒性出血癥蜂膠佐劑、黃芪多糖佐劑、鋁膠佐劑、生理鹽水佐劑滅活疫苗，劑量為1 ml/只，對照組免疫滅菌生理鹽水。

1.8.24種疫苗抗體效價的比較。分別在免疫后7、14、28、60、90、180 d從每組中隨機抽取4只試驗兔于耳靜脈采血后分離血清，通過血凝抑制試驗（HI）測定血清中兔病毒性出血癥抗體效價。使用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與方差分析，結果以“平均值±標準差”表示。

1.8.34種疫苗攻毒保護的比較。在7、14、28、60、90、180 d采血后的4只試驗兔分別經(jīng)頸部皮下注射兔病毒性出血癥病毒，劑量為1 ml/只，隔離飼養(yǎng)，觀察7 d，記錄各組兔的發(fā)病和死亡情況，計算各組兔保護率，比較4種疫苗的免疫保護效果。

2結果與分析

2.1兔病毒性出血癥滅活抗原的檢驗采用血凝試驗（HA）測定滅活抗原對人“O”型紅細胞的凝集效價為1∶1 024；按照現(xiàn)行獸藥典的方法檢驗滅活抗原無細菌、霉菌和支原體生長。

2.24種疫苗的物理性狀檢驗按照現(xiàn)行獸藥典的方法檢驗4種滅活疫苗均為均勻混懸液。

2.34種疫苗的無菌檢驗按照現(xiàn)行獸藥典的方法檢驗4種滅活疫苗均無細菌、霉菌、支原體生長。

2.44種疫苗的安全性檢驗4種滅活疫苗注射的健康易感家兔全部健活，無任何不良反應。

2.54種疫苗的效力檢驗

2.5.1抗體效價的比較。由表1可知，在免疫后的7 d 4種疫苗RHDV抗體效價均逐步升高，其中以黃芪多糖佐劑滅活疫苗的效價最高，鋁膠佐劑滅活疫苗的抗體效價最低，黃芪多糖佐劑、蜂膠佐劑顯著高于鋁膠佐劑（P<0.05）；免疫后的14 d，黃芪多糖佐劑滅活疫苗顯著高于蜂膠佐劑、鋁膠佐劑以及常規(guī)滅活疫苗（P<0.05）；免疫后的28 d，黃芪多糖佐劑、蜂膠佐劑、鋁膠佐劑滅活疫苗抗體效價相當，差異不顯著（P>0.05），均顯著高于常規(guī)滅活疫苗（P<0.05）；免疫后的60 d，4種滅活疫苗的RHDV抗體效價仍然維持在較高水平，黃芪多糖佐劑、蜂膠佐劑鋁膠佐劑滅活疫苗的抗體效價均顯著高于常規(guī)滅活疫苗（P<0.05）；免疫后的120 d，4種滅活疫苗的RHDV抗體效價均有所下降；免疫后的180 d，黃芪多糖佐劑、蜂膠佐劑、鋁膠佐劑滅活疫苗抗體效價仍維持在5 log2以上，其中以黃芪多糖佐劑抗體效價最高，其顯著高于常規(guī)滅活疫苗差異（P<0.05）。

2.5.24種疫苗攻毒保護效果的比較。由表2可知，在免疫后7 d，4種滅活疫苗均能有效抵抗兔病毒性出血性病毒的攻擊，保護率均達到100%，而未免疫的對照組全部死亡；免疫后120 d，4種滅活疫苗的抗體滴度雖然已有所下降，但其保護率仍然可達到100%；免疫后180 d，4種滅活疫苗的保護率均下降，其中常規(guī)滅活疫苗的保護率最低達25%，蜂膠佐劑與鋁膠佐劑可達到50%，黃芪多糖佐劑的保護率最高達75%。

表24種滅活疫苗攻毒保護結果（存活數(shù)/攻毒數(shù)）

處理7 d14 d28 d60 d120 d180 d蜂膠佐劑4/44/44/44/44/42/4黃芪多糖佐劑4/44/44/44/44/43/4鋁膠佐劑4/44/44/44/44/42/4常規(guī)滅活疫苗4/44/44/44/44/41/4對照組0/40/40/40/40/40/4

3討論

筆者利用實驗室近期分離的強毒株分別研制了蜂膠佐劑、黃芪多糖佐劑、鋁膠佐劑、生理鹽水4種滅活疫苗，將4種疫苗進行比較，結果表明4種疫苗均具有良好的安全性，但免疫效果存在一定的差異，黃芪多糖佐劑滅活疫苗產生抗體最快，在免疫后7 d其抗體滴度可以達到7.50 log2，在免疫后14 d其血清抗體水平顯著高于蜂膠苗和鋁膠苗，且抗體維持時間較長，在免疫后180 d抗體效價仍可以達到5.75 log2，保護率達75%；鋁膠佐劑滅活疫苗產生抗體較慢，免疫后7 d其抗體滴度達到6.25 log2，在免疫后28 d其血清抗體水平才達到黃芪多糖苗和蜂膠苗；常規(guī)滅活疫苗抗體水平維持時間較短，免疫后180 d其抗體效價已降到4.75 log2，保護率達25%；鋁膠苗和蜂膠苗抗體維持時間較長，在免疫后180 d抗體效價分別為5.50 log2和5.25 log2，攻毒保護達50%。由此可見，黃芪多糖和蜂膠作為天然的免疫增強劑，具有一定的藥理活性和保健功能，以其作為佐劑的RHDV滅活疫苗吸收快，抗體產生效價高且維持時間較長，是值得進一步推廣應用的新型疫苗；常規(guī)滅活疫苗中的組織抗原成分可在短時間內被動物機體大量吸收，產生較高水平的抗體，但維持時間較短。鋁膠佐劑由于抗原成分釋放緩慢，產生高水平抗體所需時間較長，但其維持時間可與蜂膠佐劑相當。

該研究結果表明，當RHDV抗體效價為6.25 log2時，可以抵抗RHDV強毒的攻擊；當抗體效價達5.75 log2時，不能完全抵抗RhDV強毒的攻擊，初步確定了RHDV血凝抑制抗體效價和攻毒保護率之間的關系。該研究還表明RHDV滅活疫苗免疫4個月后4種疫苗的保護率均可達到100%，而免疫6個月后4種疫苗的保護率均沒有達到100%，因此，確定RHDV的免疫期為4～6個月，絕對不能超過6個月，否則無法有效控制RHDV的發(fā)生與流行。

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