廣藿香α—淀粉酶PcAMY1基因克隆和序列分析

歐陽(yáng)蒲月等

摘 要 為了解廣藿香對(duì)淀粉的利用，克隆了廣藿香（Pogostemon cablin）的α-淀粉酶（alpha-amylase，AMY）基因，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。搜索本課題組建立的廣藿香轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得AMY基因全長(zhǎng)序列，并設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證；利用生物信息學(xué)軟件對(duì)AMY基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。本研究獲得的廣藿香AMY基因命名為PcAMY1基因（GenBank登錄號(hào)為KC862311），該基因全長(zhǎng)1 420 bp，編碼422個(gè)氨基酸?；谏镄畔④浖治隽薖cAMY1基因編碼蛋白的理化特性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，PcAMY1基因與牽牛（Ipomoea nil）的AMY序列同源性最高，與赤豆（Vigna angularis）、菜豆（haseolus vulgaris）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）等植物次之，與自然進(jìn)化關(guān)系保持一致。PcAMY1基因在廣藿香嫩莖、成熟莖、老莖、 嫩葉、成熟葉、老葉中均有表達(dá)，但在老莖中表達(dá)量最高。成功克隆到廣藿香PcAMY1基因，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)與基因表達(dá)分析。

關(guān)鍵詞 廣藿香；α-淀粉酶；PcAMY1基因；基因克?。簧镄畔W(xué)分析

中圖分類號(hào) R282.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Analysis of Alpha-amylase（PcAMY1）

Gene in Pogostmen cablin

OUYANG Puyue1， LIU Yongliang2， WANG Ying3， YAN Zhen1 *

1 Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou， Guangdong 510520， China

2 Wuhan Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Wuhan， Hubei 430074， China

3 South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou， Guangdong 510650， China

Abstract Objective In order to understand the using process of starch in Pogostemon cablin， an alpha-amylase gene PcAMY1 was cloned and analyzed bioinformatically. Methods The full length AMY gene sequence was retrieved from transcriptomic database of P. cablin， the full length primer was designed for PCR verification， and PcAMY1 gene was analyzed using several bioinformatical softwares. Results PcAMY1（NCBI accession， KC862311）contained1 420 bp length of open reading frame（ORF）and encoded 422 amino acids postulated. Additionally， the physical and chemical properties of PcAMY1-coded protein were analyzed by bioinformatical softwares. Phylogenetic analysis showed that PcAMY1 was tightly clustered with AMY genes in Ipomoea nil， Vigna angularis， and haseolus vulgaris， which is consistent to the phylogenetic relationship of species. The expression level of PcAMY1 was most abundantly in P. cablin old stem， followed by mature leaf， that for other organs was low. Conclusion PcAMY1 is successfully coloned and molecularly characterized. The results would lay a fundamental foundation for P. cablin researches.

Key words Pogostemon cablin（Blanco）Benth； Alpha-amylase； PcAMY1 gene； Gene cloning； Bioinformatical analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.022

植物和光合微生物如藍(lán)藻、真菌等可直接利用光合作用合成淀粉并儲(chǔ)存在體內(nèi)，動(dòng)物和非光合微生物則只能利用現(xiàn)成的淀粉。淀粉的利用必須具有能催化α-1，4-糖苷鍵的淀粉酶，即α-amylase（AMY）。從低等的細(xì)菌、真菌到高植物體內(nèi)都含有α-淀粉酶。目前對(duì)于α-淀粉酶（AMY）基因的研究已在細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物中均有報(bào)道[1-7]。國(guó)內(nèi)對(duì)AMY基因的研究主要集中在動(dòng)物和菌類植物方面[1-3]。國(guó)外對(duì)AMY基因的研究，主要集中在淀粉含量高的植物如百合、郁金香、風(fēng)信子及谷類植物等[4-7]，并進(jìn)行了AMY基因克隆、表達(dá)及分析方面的研究，結(jié)果表明，AMY基因在種子萌發(fā)、球根作為繁殖器官兩方面[8-13]發(fā)揮了重要的作用。

廣藿香[Pogostemon cablin（Blanco）benth]為唇形科剌蕊草屬植物，以全草入藥。味辛，性微溫，歸脾、胃、肺經(jīng)。廣藿香原產(chǎn)于菲律賓、馬來(lái)西亞、印度等國(guó)家，自宋代傳入中國(guó)已有1000余年歷史[14]，是中成藥/醫(yī)藥、香料/化妝品等的主要原料。近年來(lái)，每年國(guó)內(nèi)市場(chǎng)廣藿香揮發(fā)油需求量約220 t而年產(chǎn)量?jī)H為40～50 t，出現(xiàn)了嚴(yán)重的供需矛盾。因此，加速推進(jìn)廣藿香萜類物質(zhì)生物合成的分子機(jī)制研究，提高廣藿香萜類物質(zhì)尤其是廣藿香醇含量，是當(dāng)前廣藿香研究的重要課題。最新藥理藥效研究表明，廣藿香提取物中的萜類化合物具有殺錐蟲[15]、殺螨[16]、抗流感病毒[17]等活性。值得注意的是：植物體內(nèi)萜類化合物的合成主要前體物質(zhì)是糖，且糖經(jīng)過(guò)糖酵解途徑、以及MEP和/或MVA等途徑合成種類繁多的萜類物質(zhì)[18]。而α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）在淀粉水解過(guò)程扮演重要角色，從而有利于其他酶類參與該降解過(guò)程，最終將淀粉降解為生物可利用的單糖[19]。由此可見(jiàn)，α-淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生單糖是大量合成廣藿香萜類物質(zhì)的關(guān)鍵酶。

鑒于α-淀粉酶在萜類物質(zhì)合成的重要性，目前廣藿香的AMY基因的克隆與蛋白結(jié)構(gòu)和功能方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究組利用前期研究中獲得了大量的廣藿香轉(zhuǎn)錄組信息，挖掘到一條AMY基因序列；并采用PCR技術(shù)克隆廣藿香PcAMY1基因全長(zhǎng)序列、對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；采用RealtimePCR技術(shù)對(duì)其不同時(shí)期不同部位進(jìn)行了PcAMY1基因表達(dá)分析，為豐富廣藿香的分子生物學(xué)信息奠定了基礎(chǔ)，并希望能在后期調(diào)控AMY基因，以期為廣藿香更深入的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)材料采自于廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院藥用植物標(biāo)本園廣藿香栽培地。選取海南廣藿香展開(kāi)幼葉及成熟黃褐色葉，迅速放入裝有液氮的保溫瓶中，后置于-75 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取 取-75 ℃保存的幼葉及成熟葉，在180～200 ℃烘烤過(guò)的研缽中用液氮將其充分研磨，迅速倒入DEPC處理過(guò)2.3.5 PcAMY1基因不同組織表達(dá)分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到PcAMY1基因在廣藿香的嫩莖、成熟莖、老莖、 嫩葉、成熟葉、老葉中均有表達(dá)，但老莖中表達(dá)量最高（圖8）。

3 討論與結(jié)論

本研究成功克隆了廣藿香的α-淀粉酶（PcAMY1）基因，其cDNA全長(zhǎng)1 420 bp，編碼422個(gè)氨基酸，并對(duì)其測(cè)序并進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析[22]。α-淀粉酶具有水解淀粉產(chǎn)生單糖的功能[18]，而萜類物質(zhì)是由單糖經(jīng)過(guò)糖酵解、MVA、MEP途徑而合成的[19]；因而α-淀粉酶在源頭上起到調(diào)控著萜類物質(zhì)代謝流大小的作用。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)PcAMY1基因在廣藿香的嫩莖、成熟莖、老莖、嫩葉、成熟葉、老葉中均有表達(dá)說(shuō)明該基因表達(dá)存在普遍性，而葉的3個(gè)時(shí)期中成熟葉表達(dá)最高，成熟葉大，顏色綠，α-淀粉在光合作用中起著非常大的作用；莖的3個(gè)時(shí)期中老莖表達(dá)最高，3種不同時(shí)期的莖，嫩莖、成熟莖、老莖相比，老莖的纖維含量最高，成熟莖次之，嫩莖含纖維最少，這說(shuō)明α-淀粉酶在纖維的形成中可能起著一定的作用。目前在其它物種中尚未有AMY基因的表達(dá)研究。

基于AMY基因利用NJ法構(gòu)建的12個(gè)不同物種間的進(jìn)化樹(shù)表明PcAMY1基因與牽牛（Ipomoea nil）的AMY序列同源性最高，與赤豆（Vigna angularis）、菜豆（haseolus vulgaris）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）等植物次之。與關(guān)系最近的牽牛均為合瓣花，較近的均為雙子葉植物，再與較遠(yuǎn)的為單子葉植物集成一類。這與植物發(fā)育進(jìn)化一致。序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，本研究克隆得到的PcAMY1基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登陸的其他物種的α-淀粉酶基因具有很高的同源性和較近的親緣關(guān)系。廣藿香的PcAMY1基因克隆及生物信息學(xué)分析研究，旨在豐富廣藿香的分子生物學(xué)信息奠定基礎(chǔ)，并在后期的對(duì)AMY基因進(jìn)行功能剖析，以期為廣藿香更深入的研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 廖 芳. 野桑蠶淀粉酶基因的分段克隆， 序列分析及其分子系統(tǒng)學(xué)研究[D]. 北碚： 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2003.

[2] 潘俐玲. 大珠母貝和企鵝珍珠貝組織蛋白酶D基因及α-淀粉酶基因的克隆與表達(dá)分析[D]. 上海： 上海海洋大學(xué)， 2011.

[3]蔣培霞. 枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因的克隆、 表達(dá)和分析[D]. 洛陽(yáng)： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2004.

[4] Nakayama A， Park S， Zheng J， et al. Immunohis to chemistry of active gibberellins and gibberellin-inducible alpha-amylase in developing seeds of morning glory[J]. Plant Physiol， 2002， 129（3）： 1 045-1 053.

[5] Mar S S， Mori H， Lee J H， et al. Purification， characterization， and sequence analysis of two alpha-amylase isoforms from azuki bean， Vigna angularis， showing different affinity towards beta-cyclodextrin sepharose[J]. Biosci Biotechnol Biochem， 2003， 67（5）： 1 080-1 093.

[6] Mori H， Kobayashi T， Tonokawa T， et al. Molecular cloning of an alpha-Amylase cDNA from germinating cotyledons of kidney bean（Phaseolus vulgaris L. cv. Toramame）[J]. Appl Glycosci， 1997， 45： 261-267.

[7] Kamas H J， Breathwaite E K， Prasse C E， et al. Multiple roles of soluble sugars in the establishment of gunnera-nostoc endosymbiosis[J]. Plant Physiol， 2010， 154（3）： 1 381-1 389.

[8] AKazawa T， Hara-Nishimura I. Topographic aspect of bio-synthesis， extracellular secretion and intracellular storage of protein in plant cells[J]. Annu Rev Plant. Physiol， 1985， 36： 441-472.

[9] Komiyama S， yamazaki T， Hori E， et al. Degradation of storage starch in tulip bulb scales induced by cold temperature[J]. Jpn F Soil Sci Plant Nutr， 1997， 68： 23-29

[10] Labrechts H， F Rook， C. Kolloffel.Carbohydrate status of tulip bulbs during cold-induced flower stalk elongation and flowering[J]. Plant Physiol， 1994， 104： 515-520

[11] Gubler F P M， Chandler R G， White D J， et al. Gibberellin signaling in barley aleurone cells： Control of SLN1 and GAMYB expression[J]. Plant PHysiol， 2002， 129： 191-200.

[12] Shin K S， Chakrabarty K Y. Peak.Sprouting rate， change of carbohydrate contents and related enzymes during cold treatment of lily bulblets regenerated in vitro[J]. Scientia Hort， 2002， 96： 195-204.

[13] Prphanides G， T Lagrange， D. Reinberg. The general transcription factors of RNA polymerase Ⅱ[J]. Genes Dev， 1996， 10： 2 657-2 683.

[14] 吳友根， 郭巧生， 鄭煥強(qiáng). 廣藿香本草及引種歷史考證的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2007， 20： 2 114-2 117.

[15] Kiuchi F， Matsuo K， Ito M， et al. New sesquiterpene hydroperoxides with trypanocidal activity from Pogostemon cablin[J]. Chem Pharm Bull， 2004， 52： 1 495-1 496.

[16] Wu H Q， Li L， Li J， et al. caricidal activity of DHEMH， derived from patchouli oil， against house dust mite， Dermatophagoides farinae[J]. Chem Pharm Bull， 2012， 60： 178-182.

[17] Kiyohara H， Ichino C， Kawamura Y， et al. Patchouli alcohol： in vitro direct anti-influenza virus sesquiterpene in Pogostemon cablin Benth[J]. J Natl Med， 2012， 66： 55-61.

[18] Dudareva N， Klempien A， Muhlemann J K， et al. Biosynthesis， function and metabolic engineering of plant volatile organic compounds[J]. New Phytol， 2013， 198： 16-32.

[19] Beck E， Ziegler P. Biosynthes is and degradation of starch in higher plants[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol， 1989， 40： 95-117.

[20] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-[△][△]CT method[J]. Methods 25， 2001： 402-408.

[21] 國(guó)家藥典委員會(huì)， 中華人民共和國(guó)藥典[M]（一部）. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010.

[22] Sun Y Z， Niu Y Y， Li Y， et al. Cloning and bioinformatics analysis of PqERF1 gene in Panax quinquefolius[J]. Acta Pharm Sin， 2011， 46： 1 008-1 014.