李言等

摘 要：為了建立一個重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高，適用于海帶屬ISSR遺傳分析的PCR反應體系，從海帶屬配子體材料中提取基因組DNA作為模板，應用正交設(shè)計試驗對反應體系中各因子的不同濃度進行組合優(yōu)化。結(jié)果顯示：適用于海帶ISSR擴增反應的最佳體系（20 μL）為：1×PCR buffer，1.2 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L ISSR引物，40 ng 模板DNA，0.25 U Taq DNA 聚合酶；擴增PCR程序為：95℃預變性3 min；95℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。在優(yōu)化的海帶ISSR反應條件下，擴增條帶穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，為應用ISSR分子標記技術(shù)進行海帶屬遺傳多樣性研究和分子鑒定奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：海帶屬；配子體；DNA提??；ISSR；體系優(yōu)化

中圖分類號：Q75 文獻標志碼：A 論文編號：2013-0938

Genomic DNA Extraction and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Saccharina

Li Yan， Cui Cuiju， Luo Shiju， Li Xiaojie， Zhao Juping， Sai Shan， Qian Rui， Wu Ruina

（Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd/National Alage Project Technology Research Centre/

Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology Key Laboratory of Shandong Province， Yantai 264003， Shandong， China）

Abstract： In order to establish a reproducible， stable， and suitable reaction system of Saccharina for ISSR analysis of genetic differences， the genomic DNA extracted from gametophytes of Saccharina was used as template， the different concentrations of the factors in reaction system were optimized by orthogonal design experiment. The results showed that， the optimal ISSR reaction system （20 μL） contained 1 ×PCR buffer， 1.2 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 1 μmol/L ISSR primer， 40 ng template DNA and 0.25 U Taq DNA polymerase. The PCR program was pre-denatured at 95℃ for 3 min and followed by 38 cycles of 45 s at 95℃， 45 s at 52℃， 2 min at 72℃， and final extension of 10 min at 72℃. The optimal ISSR reaction system was stable and repeatable. This system could provide the technical foundation for the application of ISSR molecular marker technology for the study on genetic diversity and molecular identification of Saccharina.

Key words： Saccharina； Gametophyte； DNA Extraction； ISSR； System Optimization

0 引言

海帶（Saccharina japonica）屬于褐藻門（Phaeophyta）、海帶目（Laminariales）、海帶科（Laminariaceae） 、海帶屬（Saccharina）藻類，19世紀20年代從日本首次引進，并逐漸適應中國海域條件，現(xiàn)在是中國人工栽培歷史最長、產(chǎn)量最高的大型經(jīng)濟海藻，在醫(yī)藥、食品、化工等方面都有廣泛的應用[1-2]。近年來，中國又陸續(xù)引進了多個海帶種類如Saccharina longissima、 Saccharina angustata、Saccharina ochotensis、Saccharina religiosa等豐富了海帶種質(zhì)資源，也為開展遺傳育種和新品種雜交選育工作提供了材料[3-4]。海帶的分子遺傳學方面的基礎(chǔ)研究開展較晚，目前針對海帶遺傳多樣性研究的報道中主要以SSR、RAPD標記技術(shù)為主[5-6]。ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat，簡單重復間序列）是在1994年由Ziekiewicz等[7]在SSR標記的基礎(chǔ)上開發(fā)的一種新的分子標記，與SSR標記相比，ISSR不需要預先知道基因組的序列信息，也不需要開發(fā)引物，成本低、操作簡便、反應的遺傳多態(tài)性豐富。但在使用ISSR標記進行PCR擴增試驗時，不同物種的試驗材料對引物反應條件的要求也不同，因此需要對引物進行篩選和反應體系的優(yōu)化。邵峰等[8]采用高鹽低pH法提取紫色觀賞辣椒的基因組DNA，并通過正交設(shè)計試驗優(yōu)化了ISSR-PCR反應體系；陳名紅等[9]采用單因素試驗對影響百合ISSR-PCR反應體系中的6個主要因素進行優(yōu)化篩選，建立了適合百合屬的ISSR最佳反應體系；汪斌等[10]篩選出適合紅麻的ISSR引物，進行了體系優(yōu)化，并利用ISSR擴增條帶建立了6份紅麻種質(zhì)材料的指紋數(shù)據(jù)庫；王新宇等[11]用ISSR分子標記技術(shù)構(gòu)建了多態(tài)性水平較低的小麥種內(nèi)指紋圖譜，能將親緣關(guān)系很近的品種或品系區(qū)分開。目前，ISSR已被廣泛應用于物種的系統(tǒng)發(fā)育，品種鑒定和遺傳多樣性研究[12-14]，目前在國內(nèi)，沈永寶等[15]、陳海云等[16]是利用ISSR分子標記技術(shù)在種質(zhì)鑒定方面做得較好的專家。在海帶屬的分子標記技術(shù)研究中，尚未見有對ISSR反應體系優(yōu)化的相關(guān)報道，因此本研究以海帶配子體的基因組DNA為模板，應用正交設(shè)計試驗對海帶ISSR-PCR反應體系進行優(yōu)化，為后續(xù)開展海帶品種鑒定和遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以保存在國家海藻工程技術(shù)研究中心海藻種質(zhì)庫的海帶配子體為試驗材料，取狀態(tài)良好，干凈的克隆材料進行DNA提取。

1.2 基因組DNA提取

采用改進的CTAB法提取配子體基因組DNA，具體方法：取0.1 g濕重的配子體材料，盡可能的吸干水分，在1.5 μL離心管中，加入100 μL 2×CTAB提取緩沖液，包括2% CTAB（W/V），2%PVP（polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮），100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA（ pH 8.0），1.4 mmol/L NaCl，2%β-巰基乙醇（V/V）。用尖頭研磨棒在離心管中將配子體迅速研碎，再加入600 μL 2×CTAB提取緩沖液，置于65℃水浴30 min， 期間每隔5 min上下顛倒數(shù)次；4℃1200 r/min 離心10 min；取上清，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），輕搖混勻； 4℃1200 r/min離心10 min；重復上述兩個步驟2～3次，直至有機相和水相界面無白色蛋白層；加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻后-20℃靜置2 h；4℃1200 r/min 離心10 min；70%乙醇洗滌2～3次，超凈工作臺中風干，加80 μL的TE溶解，用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的濃度和純度。DNA濃度統(tǒng)一稀釋為40 ng/μL以方便后續(xù)使用。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR反應體系的優(yōu)化

參照哥倫比亞大學公布的ISSR引物序列（UBC801-UBC900），由上海捷瑞生物工程有限公司合成，經(jīng)預試驗篩選，對Mg2+，dNTP，引物濃度，Taq DNA 聚合酶（Promega，USA）4個因素，分別取3個水平，設(shè)計L9（34）正交表進行正交試驗（表1），取最適反應體系，進行退火溫度的梯度試驗。PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶配子體基因組DNA的提取

提取的海帶配子體DNA條帶整齊，無降解和雜質(zhì)污染（圖1）。紫外分光光度計測定的A260/A280比值在1.9左右，濃度約為50～100 ng/μL，可滿足試驗需要。該方法不需使用液氮研磨，只需用很少的試驗材料便可提取質(zhì)量符合要求的基因組DNA。

2.2 海帶配子體ISSR反應體系優(yōu)化

本試驗根據(jù)4因素3水平正交設(shè)計表共有9個試驗組合，PCR擴增結(jié)果見圖2，可知，除個別泳道條帶模糊之外，大部分組合都能擴出清晰的條帶。綜合考慮各因素及用量，覺得第5號組合擴增效果最好，擴增位點多，條帶清楚，該體系（20 μL）為：1×PCR buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L 引物，40 ng 模板DNA，0.25 U Taq DNA 聚合酶；擴增PCR程序為：95℃預變性3 min；95℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。選取5號組合的反應體系進行溫度梯度試驗，另選取4個個體，分設(shè)48、52、55℃3個溫度，擴增結(jié)果電泳圖譜見圖3。48℃時擴增條帶明亮、清晰、擴增效率高，但相比較52℃條件下，個體間的特異條帶較多，能較好地反映出個體間的差異，雖然擴增效率不如48℃高，但條帶也清晰可見。所以綜合各方面考慮，選取52℃作為最適反應條件，用于后續(xù)群體的擴增。

2.3 海帶配子體ISSR反應體系穩(wěn)定性檢測

利用優(yōu)化的ISSR反應體系，選擇12個海帶配子體材料DNA，對該體系進行穩(wěn)定性檢測，從圖4可以看出，經(jīng)正交試驗優(yōu)化和溫度梯度試驗后的PCR體系擴增出的條帶清晰、位點多，表明該體系穩(wěn)定可靠，可用于后續(xù)海帶配子體種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析等相關(guān)研究。

3 結(jié)論

試驗找到了一種適用于ISSR-PCR反應的海帶基因組DNA提取方法，該方法不需使用液氮研磨，只需用很少的試驗材料便可提取質(zhì)量符合要求的基因組DNA，節(jié)約材料。通過預試驗和多因子正交設(shè)計試驗得到適合海帶的ISSR-PCR反應體系：1×PCR buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L ISSR引物，40 ng模板DNA，0.25U Taq DNA聚合酶；擴增PCR程序為：95℃預變性3 min；95℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38個循環(huán)；72℃延伸10 min。

姜翠翠等[17]研究發(fā)現(xiàn)PCR反應體系中的各因素間存在一定的互作效應，所以本試驗用正交試驗代替單因素試驗進行PCR體系的優(yōu)化，對ISSR-PCR反應體系中主要的4個因素（Mg2+、dNTP、引物濃度、Taq DNA 聚合酶）分別選取3個水平進化優(yōu)化試驗。從試驗結(jié)果看出：不同的引物濃度對擴增的條帶有無或亮度無明顯影響，但Mg2+濃度對條帶的影響非常明顯，當Mg2+濃度低時，出現(xiàn)部分條帶的缺失；dNTP濃度的影響也無明顯差異；退火溫度影響擴增條帶的式樣，這點研究結(jié)果與邵峰等[8]和陳名紅等[9]的研究相符合。

4 討論

ISSR-PCR反應對基因組DNA的質(zhì)量要求很高，預試驗中也采用基因組DNA提取試劑盒（天根，中國）進行過海帶的基因組DNA提取，但因海帶本身含多糖、多酚，目前還沒有針對海帶專門設(shè)計的基因組提取試劑盒，所以效果不佳。本試驗采用直接研磨配子體法，并利用改良的CTAB法進行基因組DNA的提取，得到的DNA純度好、無雜質(zhì)、無降解，在PCR擴增中穩(wěn)定性高。但此方法步驟較繁瑣，還需用到有機試劑，所以還有待進一步探索研究。

在設(shè)計優(yōu)化試驗的預試驗中，試用了不同商家的Taq DNA 聚合酶，發(fā)現(xiàn)聚合酶的質(zhì)量對PCR擴增結(jié)果影響非常大，不論是從條帶的有無、帶型的清晰度，還是擴增的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性等方面都有著直接的影響，這與何禮等[18]、姜翠翠等[17]、陳名紅等[9]在進行隨機引物擴增時得出的結(jié)論相同，結(jié)合條帶擴增的質(zhì)量和DNA聚合酶的價格，評估了不同商家聚合酶的性價比，決定選用Promega生產(chǎn)的GoTaq? Flexi DNA 聚合酶進行PCR擴增條件優(yōu)化和后續(xù)的ISSR試驗。本研究通過對ISSR-PCR反應體系中各因素的調(diào)整和優(yōu)化，建立了適合海帶進行ISSR-PCR擴增反應的體系和PCR擴增程序，為以后利用ISSR標記技術(shù)進行海帶種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析提供了技術(shù)支持。

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