毛少偉 卿晨 鄒桂花 羅甜 譚鋼

【摘要】目的 觀察僅α硫辛酸（ALA）對(duì)外源性H202誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶（HO-1）的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19細(xì)胞，用12.5mmol/L外源性過(guò)氧化氫（H2O2）作用30min后，再加入不同濃度ALA作用不同時(shí)間。RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。熒光探針?lè)ㄓ^察ROS的產(chǎn)生。同時(shí)分別采用HO-1的激動(dòng)劑CoPP和抑制劑ZnPP處理細(xì)胞，觀察ROS的變化。結(jié)果 ALA處理ARPE-19細(xì)胞后，可顯著誘導(dǎo)其表達(dá)HO-1 mRNA和蛋白，并呈一定的劑量依賴性。同時(shí)，H2O2處理后能顯著誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS，而經(jīng)不同濃度ALA處理后，ROS產(chǎn)生顯著降低。結(jié)論 α-硫辛酸誘導(dǎo)氧化應(yīng)激下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)HO-1，從而抑制ROS的過(guò)度產(chǎn)生。

【關(guān)鍵詞】α-硫辛酸；氧化應(yīng)激；血紅素氧合酶-1；活性氧

年齡相關(guān)性黃斑變性（Age-related Macular Degeneration，AMD）是一種隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)的雙側(cè)、進(jìn)行性視網(wǎng)膜黃斑部退行性病變，是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的不可逆性致盲眼病，也是我國(guó)50歲以上人群中最重要的致盲性疾病之一。AMD的病理改變主要累及視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）、感光細(xì)胞層和脈絡(luò)膜界面。RPE細(xì)胞都是病變的中心環(huán)節(jié)之一，RPE具有很高氧化應(yīng)激易感性。因而長(zhǎng)期氧化應(yīng)激導(dǎo)致的RPE細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能異常被認(rèn)為是引發(fā)AMD的重要原因。α硫辛酸（alpha lipoic acid，ALA）是一種理想的生物抗氧化劑，它廣泛存在于自然界中，具有強(qiáng)大的抗氧化作（是維生素C的400倍），也是存在于線粒體內(nèi)的輔酶，生物相容性和利用度很好[1]。本研究試圖證實(shí)ALA對(duì)氧化應(yīng)激下RPE細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

熒光染料H2DCFDA購(gòu)自Molecular Probes公司。H2O2、鈷原卟啉 IX（CpPP），錫原卟啉IX（SnPP）為Sigma-Aldrich產(chǎn)品為Sigma產(chǎn)品。HO-1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz。RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物。其余分析純產(chǎn)品主要購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

ARPE-19細(xì)胞用含20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、H2O2處理組和ALA干預(yù)組。其中對(duì)照組僅加入等體積培養(yǎng)基。H2O2組細(xì)胞加入12.5mol/L H2O2培養(yǎng)30min；ALA不同濃度干預(yù)組：ARPE-19細(xì)胞經(jīng)H2O2作用后，再加入10，20和30μmol/L ALA作用4h。

1.3 RT-PCR

采用Trizol提取RNA，并根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行RT-PCR。HO-1-mRNA 表達(dá)水平以β-actin 為內(nèi)對(duì)照，逆轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa 公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陰性對(duì)照用每個(gè)樣本直接行PCR，不加引物和摸板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳，紫外燈下照像，在圖像分析系統(tǒng)上進(jìn)行密度掃描，用HO-1 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度比值表示HO-1的基因表達(dá)水平。

1.4 Western blot

根據(jù)試劑盒（江蘇碧云天）提供的方案獲取細(xì)胞總蛋白。收集蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。隨后用含0.1%吐溫-20和5%脫脂奶粉的TBS封閉，孵育一抗、二抗，ECL顯影。

1.5 ROS檢測(cè)

以H2DCFDA為熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。其原理是不發(fā)熒光的H2DCFDA進(jìn)入細(xì)胞后能被過(guò)氧化物、氫過(guò)氧化物等氧化分解為二氯熒光黃而產(chǎn)生熒光。孵育結(jié)束后，向各管中加入終濃度5 μmol/L的H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min。PBS洗細(xì)胞3次，重懸細(xì)胞，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞懸液熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用one-way方差分析并行Students t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALA對(duì)ARPE-19細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組HO-1表達(dá)水平極低，H2O2處理后，HO-1僅有輕微增高。隨著ALA劑量的增加，HO-1表達(dá)逐漸增多（圖1）。

1 2 3 4 5 6

圖1. ALA對(duì)HO-1 mRNA表達(dá)的影響

1：Marker；2：陰性對(duì)照；3：H2O2；4：10μmol/L ALA；5：20μmol/L ALA；6：30μmol/L ALA2.2 ALA對(duì)ARPE-19細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果與RT-PCR類似，HO-1蛋白的表達(dá)水平隨著ALA濃度的增加，而增高。內(nèi)參β-actin在所有組中保持恒定（圖2）。

1 2 3 4 5

圖2. ALA對(duì)HO-1 mRNA表達(dá)的影響

1：陰性對(duì)照；2：H2O2；3：10μmol/L ALA；4：20μmol/L ALA；5：30μmol/L ALA

2.2 ALA對(duì)H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響

陰性對(duì)照組僅表達(dá)少量ROS，H2O2處理后ROS水平顯著增高。ALA處理后，ROS的水平逐漸降低（圖3）。

1 2 3 4 5

圖3. ALA對(duì)ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響

1：陰性對(duì)照；2：H2O2；3：10μmol/L ALA；4：20μmol/L ALA；5：30μmol/L ALA

3 討論

ROS是指化學(xué)性質(zhì)活潑、氧化能力強(qiáng)大的一類含氧物質(zhì)，包括自由基、過(guò)氧化氫（H2O2）等；在生物體內(nèi)，ROS是一種非常重要的生物信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，但ROS的異常增多可導(dǎo)致脂質(zhì)的氧化、蛋白質(zhì)的破碎、交聯(lián)與聚集，同時(shí)還可導(dǎo)致DNA堿基的氧化。最終可造成細(xì)胞的功能障礙及死亡。視網(wǎng)膜是人體氧化反應(yīng)最劇烈的組織之一，而黃斑區(qū)為了實(shí)現(xiàn)視覺(jué)的敏銳度，排列有極高密度的視錐細(xì)胞，而血供卻極其有限，使得其更易成為氧化損傷的靶點(diǎn)。PRE細(xì)胞富含脂褐質(zhì)、黑色素、黃素、細(xì)胞色素C等光敏色素，在持續(xù)的光照下特別容易積累光氧化損傷[2]。RPE對(duì)光感受器外節(jié)盤膜的吞噬也為其帶來(lái)進(jìn)一步的氧化應(yīng)激負(fù)擔(dān)。老年人的RPE細(xì)胞中的溶酶體吞噬能力和過(guò)氧化物酶的活性明顯下降，因此衰老的RPE細(xì)胞更加容易受到氧化應(yīng)激的損傷。ALA又被稱為“全能抗氧化劑”，臨床已被廣泛用于治療和預(yù)防心臟病、糖尿病等疾病，被證實(shí)對(duì)心肌細(xì)胞、胰腺B細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ALA處理后，可顯著誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。HO-1是血紅素代謝的關(guān)鍵限速酶。研究表明HO-1 及其代謝產(chǎn)物在維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過(guò)程中具有抗炎、抗增殖、抗氧化以及抗凋亡等作用[3]。例如，HO-1 表達(dá)的降低或缺失（藥物性抑制作用或HO-1 基因敲除小鼠）使機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性降低，從而誘發(fā)廣泛的氧化性損傷或器官衰竭，因此，ALA對(duì)AMD的保護(hù)作用可能通過(guò)上調(diào)HO-1表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)镠O-1激動(dòng)劑CoPP能進(jìn)一步降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，而其抑制劑ZnPP處理后則能逆轉(zhuǎn)此過(guò)程。

綜上所述，本研究初步證實(shí)ALA可能通過(guò)HO-1途徑抑制H2O2刺激下ARPE-19細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，從而促ROS的清除，最終阻止或者延AMD的發(fā)生。

資助項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81100648）

參考文獻(xiàn)

[1]Rochette L， Ghibu S， Richard C， et al. Direct and indirect antioxidant properties of alpha-lipoic acid and therapeutic potential[J]. Mol Nutr Food Res， 2013，57（1）：114-125.

[2]Bertram KM， Baglole CJ， Phipps RP， et al. Molecular regulation of cigarette smoke induced-oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells： implications for age-related macular degeneration[J]. Am J Physiol Cell Physiol， 2009，297（5）：C1200-1210.

[3]Synowiec E， Szaflik J， Chmielewska M， et al. An association between polymorphism of the heme oxygenase-1 and -2 genes and age-related macular degeneration[J]. Mol Biol Rep， 2012，39（3）：2081-2087.