孟冬冬，張坤迪，英 瑜，陳曉華，李福利

(1.中國科學院 青島生物能源與過程研究所，青島 266101;2.中國科學院大學，北京 100049;3.中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071)

化石能源是一種不可再生資源，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，日益增大的能源需求及能源儲量的減少逐漸成為制約人類發(fā)展的一大瓶頸。木質(zhì)纖維素作為地球上廣泛存在的可再生資源，將其轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的單糖或寡糖，是解決能源危機的有效途徑。在這一轉(zhuǎn)化過程中，纖維素酶是決定其能否高效進行的關(guān)鍵。因此，尋找具有高效木質(zhì)纖維素降解能力的菌株并對其進行深入研究成為人們關(guān)注的焦點。

Caldicellulosiruptor屬菌株屬于極端嗜熱厭氧菌，具有極強的木質(zhì)纖維素降解能力。從20世紀80年代第一個Caldicellulosiruptor屬菌株C.saccharolyticus DSM 8903分離以來［1］，人們又陸續(xù)分離得到了7個同屬的菌株，并分別研究了它們的生理生化性質(zhì)及木質(zhì)纖維素降解能力。伴隨著8株菌的基因組測序完成，人們在其遺傳轉(zhuǎn)化體系及相關(guān)纖維素酶的研究方面也取得了一系列研究進展。本文中筆者將對Caldicellulosiruptor屬菌株的研究現(xiàn)狀及前景進行綜述和展望。

1 極端嗜熱纖維素降解厭氧菌的多樣性

微生物根據(jù)其最適生長溫度可以分為嗜熱微生物(50～70℃)和極端嗜熱微生物(＞70℃)，而最適生長溫度大于80℃的極端嗜熱微生物又稱為超嗜熱微生物［2］。在高溫環(huán)境下，由于O2溶解度低及存在一些還原性氣體，這種生態(tài)環(huán)境下的微生物多為厭氧或微好氧微生物。極端嗜熱微生物分布廣泛，包括溫泉、火山口、淺海海灘、深海地熱口以及生物堆肥等生態(tài)環(huán)境［3］。目前，在多個屬中發(fā)現(xiàn)有極端嗜熱纖維素降解厭氧菌，包括Thermotoga、Caldicellulosiruptor、Thermoanaerobacter、Thermoanaerobacterium和Clostridium屬等。

與常溫微生物一樣，嗜熱厭氧菌也需要通過一系列的機制獲得營養(yǎng)和能源。嗜熱厭氧菌利用其豐富的糖苷水解酶(GHs)及轉(zhuǎn)移酶(GTs)將自然界中各種簡單或復雜的碳水化合物轉(zhuǎn)化成自身的C源和能源，同時也為我們提供了豐富的嗜熱纖維素酶庫。與常溫纖維素酶相比，這些來源于嗜熱厭氧菌的纖維素酶具有熱穩(wěn)定性好、半衰期長等優(yōu)點，因此可以提高酶的使用效率，在生產(chǎn)中降低酶的用量，減少生產(chǎn)成本。

2 Caldicellulosiruptor屬菌株降解未預處理木質(zhì)纖維素的研究進展

Caldicellulosiruptor屬目前包含8個種，屬于革蘭氏陽性菌，GC含量較低，而且不產(chǎn)生孢子。它們的最適生長溫度在65～78℃，可以高效降解多種復雜碳水化合物。與多個Clostridium菌株不同的是，Caldicellulosiruptor菌株不產(chǎn)生纖維小體，而是將游離的纖維素酶分泌到周圍環(huán)境中。Caldicellulosiruptor菌株可以同時發(fā)酵C5和C6的單糖，是整合生物加工工藝(CBP)的優(yōu)先候選者。

2.1 Caldicellulosiruptor屬菌株具有廣泛的底物利用譜

C.saccharolyticus是從新西蘭淡水溫泉中分離得到的嗜熱厭氧菌，能夠利用纖維素、半纖維素以及果膠等生物質(zhì)，是Caldicellulosiruptor屬分離得到的第一個模式菌株［1］。C.saccharolyticus可以同時發(fā)酵C5和C6單糖，并有極高的產(chǎn)氫得率(1 mol葡萄糖產(chǎn)生4 mol H2)［4］。C.bescii初始稱為 Anaerocellum thermophilum，是Caldicellulosiruptor屬中研究較多的嗜熱厭氧菌［5］，可以利用未經(jīng)過預處理的木質(zhì)纖維素作為C源［6］。Caldicellulosiruptor屬菌株能代謝多種單糖和寡糖，可以同時利用葡聚糖和木聚糖作為C源，降解預處理或未預處理的木質(zhì)纖維素［4－5，7－15］(表 1)。

2.2 Caldicellulosiruptor屬菌株具有極強的降解未預處理木質(zhì)纖維素能力

木質(zhì)纖維素的主要組成是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素［16］。纖維素是植物細胞壁中含量最豐富的組成成分，是由D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成的同多糖，其聚合度在10 000或者更高。纖維素鏈間殘基通過氫鍵和范德華力維系。若干條鏈聚集成緊密的有周期性晶格的分子束，稱微晶或膠束。多個這樣的膠束平行排列組成線狀的微纖維。

半纖維素是由幾種不同類型的單糖(包括五碳糖和六碳糖)構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，其包括的單糖類型有:D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸。半纖維素多糖大多具有側(cè)鏈，聚合度小于200，側(cè)鏈常被乙?；?。在植物細胞壁中，半纖維素常與微纖維非共價結(jié)合成為基質(zhì)多糖。

木質(zhì)素是一種復雜的不溶性酚類聚合物，主要存在于植物的次生壁中，通過與多糖組分 (尤其是半纖維素)共價結(jié)合形成交織網(wǎng)來硬化細胞壁，起抗壓作用，具有較強的抗化學成分、真菌和細菌攻擊能力。

木質(zhì)纖維素的降解需要大量酶的協(xié)同作用才能完成［17］。3 類主要的纖維素酶:內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-β-1，4-glucanase，EG，EC 3.2.1.4)、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG，EC 3.2.1.21)共同作用，將β-1，4-糖苷鍵連接的纖維素葡聚糖鏈降解為單糖(圖1)。半纖維素的復雜性及異質(zhì)性決定了其完全降解過程要求更多的半纖維素酶參與其中。最常見的幾種半纖維素酶有木聚糖酶(xylanase)、β-甘露聚糖酶(β-mannanases)、α-L-阿 拉 伯 呋 喃 糖 苷 酶 (α-L-arabinofuranosidases)、α-D-葡糖醛酸糖苷酶(α-D-glucuronidase)、β-木糖苷酶(β-xylosidases)及半纖維素酯酶(hemicellulolytic esterases)(圖2)。

未預處理的木質(zhì)纖維素是指經(jīng)過粉碎、洗滌、烘干等步驟除去物質(zhì)表面的可溶性成分，從而制成的顆粒大小相對均勻的天然木質(zhì)纖維素材料，這一過程未經(jīng)過其他物理、化學處理，不涉及木質(zhì)纖維素化學鍵的斷裂及結(jié)晶結(jié)構(gòu)的破壞。Yang等［6］研究發(fā)現(xiàn):C.bescii可以有效降解未預處理的木質(zhì)纖維素。不溶性木質(zhì)纖維素底物(如柳枝稷和白楊木)粉碎后，在菌株最適生長溫度(75℃)下，懸浮在蒸餾水(0.02 g/mL)中攪拌過夜，之后經(jīng)75℃蒸餾水洗滌2次，經(jīng)濾膜篩選得到40～60 μm粒徑的顆粒，經(jīng)50℃烘干后，制成未預處理的木質(zhì)纖維素。C.bescii利用未預處理的柳枝稷和白楊木作為C源，10 h即可進入穩(wěn)定期，細胞數(shù)目達到1×108個/mL。收集培養(yǎng)菌體后，培養(yǎng)基中殘余的木質(zhì)纖維素經(jīng)上述洗滌烘干處理，制備不溶性底物。研究結(jié)果顯示，使用過1次和2次的不溶性木質(zhì)纖維素均可以作為C源支撐C.bescii的生長，菌株在15～20 h可以達到穩(wěn)定期。對用過的不溶性木質(zhì)纖維素分析顯示，作為其組成成分的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的比例沒有發(fā)生變化。菌株培養(yǎng)10 d時，未預處理的柳枝稷和白楊木利用率分別為26%和15%。上述實驗結(jié)果反映了該菌株具有獨特高效的降解未經(jīng)預處理木質(zhì)纖維素的能力。

圖1 纖維素酶及纖維素降解［17］Fig.1 Cellulase and cellulose hydrolysis［17］

圖2 半纖維素酶及半纖維素降解［17］Fig.2 Hemicellulase and hemicellulose hydrolysis［17］

筆者所在課題組篩選到的嗜熱厭氧菌Caldicellulosiruptor sp.F32，是與模式菌株Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903同種的菌株，二者比較，F(xiàn)32表現(xiàn)出更強的木質(zhì)纖維素降解能力。小麥秸稈經(jīng)過上述處理步驟制成未預處理的木質(zhì)纖維素，以其作為C源添加到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，F(xiàn)32細胞數(shù)目是模式菌株細胞數(shù)目的3倍。進一步分析F32和DSM 8903胞外酶活，結(jié)果顯示F32具有較高的內(nèi)切纖維素酶活性與木聚糖酶活性。2株菌胞外纖維素酶活性差異造成了它們木質(zhì)纖維素降解能力的強弱。

木質(zhì)纖維素是一種交聯(lián)致密的雜合物，具有較高的結(jié)晶度以及低的可及度，微生物或纖維素酶較難將其降解。微生物降解纖維素的速率隨著溫度提高急劇增大，因此，相較于嗜常溫微生物，嗜熱厭氧菌在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化方面具有巨大優(yōu)勢。Caldicellulosiruptor屬的菌株能分泌大量游離的嗜熱纖維素酶，在其最適生長溫度的高溫條件下，具有極高的木質(zhì)纖維素降解速率。另外，65～78℃的高溫環(huán)境更有利于纖維素酶與木質(zhì)纖維素的吸附以及酶對底物晶體結(jié)構(gòu)的破壞。高溫環(huán)境和豐富的、高催化效率的纖維素酶造成了Caldicellulosiruptor屬的菌株具有極強的針對未預處理木質(zhì)纖維素的降解能力。

2.3 Caldicellulosiruptor屬基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組研究進展

Caldicellulosiruptor屬8個種模式菌株的全基因組測序已經(jīng)完成，這些信息的獲得極大推動了嗜熱厭氧菌在木質(zhì)纖維素降解方面的研究。8個菌株基因組大小為2.43～2.97 Mb，基因組平均大小為2.74 Mb，平均GC含量為35.5%(表1)。Caldicellulosiruptor屬是一個巨大的纖維素酶庫，每個種的菌株都包含了37～62個糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)、1 ～4 個多糖裂解酶(polysaccharide lyase，PL)、4 ～9 個碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase，CE)以及27～35個糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferase，GT)，另 外 還 有 12～39個 ABC transporters(表2)。全屬的菌株共有4 009個ORFs編碼分布于43個家族的106個糖苷水解酶［18］。

Caldicellulosiruptor屬菌株的轉(zhuǎn)錄組測序工作也已經(jīng)取得了一些研究進展。C.bescii基因組中的2 776個蛋白編碼序列，其中有171個和88個基因與碳水化合物的轉(zhuǎn)運和利用相關(guān)。纖維素對單糖的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，有32個碳水化合物活性基因、61個糖轉(zhuǎn)移基因和25個轉(zhuǎn)錄因子得到上調(diào)［7］。Vanfossen等［19］對 C.saccharolyticus的代謝進行了轉(zhuǎn)錄組分析。葡萄糖對半乳糖的轉(zhuǎn)錄組分析顯示有32個開放閱讀框(ORFs)明顯上調(diào)，而葡萄糖對甘露糖則有353個ORFs明顯上調(diào)。該研究也探討了C.saccharolyticus的C源代謝抑制(carbon catabolite repression，CCR)作用機制。通過轉(zhuǎn)錄組及比較基因組學研究，C.saccharolyticus至少含有24個碳水化合物特異的ABC transporters以及1個磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system，PTS)。對多種單糖(阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖)的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，大多數(shù)ABC transporter僅在一種單糖或多糖作為C源時會上調(diào)，而基因Csac_0692和Csac_0694在6種單糖的混合液中才會上調(diào)，這2個基因注釋為結(jié)合蛋白(binding protein)?；蚪M及轉(zhuǎn)錄組分析顯示，大量的碳水化合物利用及轉(zhuǎn)運蛋白共同作用，從而使得菌株具有極廣的底物利用譜。

表2 Caldicellulosiruptor屬菌株碳水化合物相關(guān)模塊及轉(zhuǎn)運體系［18］Table 2 Carbohydrate-related domains and transporter inventory of the genus Caldicellulosiruptor［18］

C.bescii和C.obsidiansis的分泌蛋白中都包含 了大約400個蛋白，其中大部分為多結(jié)構(gòu)域的糖苷酶、胞外結(jié)合蛋白及功能未知的蛋白。質(zhì)譜結(jié)合纖維素酶活性測定分析表明，胞外蛋白中多結(jié)構(gòu)域的糖苷酶，如 GH5、9、10、44、48 以及 CBM3 模塊具有很高的豐度［20］。分別以纖維二糖、結(jié)晶纖維素、柳枝稷作為C源培養(yǎng)C.obsidiansis，分析其胞外蛋白組成變化。與以結(jié)晶纖維素作為底物相比，以纖維二糖為C源培養(yǎng)菌體時，可以誘導產(chǎn)生大量胞外的多功能糖苷酶;而以不溶性底物作為C源時，與運動和底物吸附相關(guān)的鞭毛、纖毛、趨藥性蛋白含量增大［21］。Caldicellulosiruptor sp.F32可以同時代謝五碳糖和六碳糖，且具有高效降解纖維素的特點。在雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)和質(zhì)譜技術(shù)的支持下，分析了Caldicellulosiruptor sp.F32在微晶纖維素和葡萄糖為C源的培養(yǎng)基中胞外蛋白的差異［22］。對微晶纖維素培養(yǎng)后大量表達的23個蛋白進行質(zhì)譜鑒定分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白包括纖維素酶、木聚糖酶、普魯蘭酶、胞外結(jié)合蛋白、S-layer蛋白、ABC transporter蛋白及未知功能的蛋白。

2.4 遺傳轉(zhuǎn)化平臺的建立

遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是進行菌株改造、機制研究的基礎(chǔ)，但由于Caldicellulosiruptor屬細菌體內(nèi)存在著許多限制修飾系統(tǒng)(restriction-modification system，RM system)，通過簡單的DNA序列分析很難準確獲得這些限制修飾酶的功能，這對遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立造成很大的困難。另外，Caldicellulosiruptor是嗜熱厭氧菌，屬于革蘭氏陽性菌，具有較厚的細胞壁，外源遺傳物質(zhì)很難通過物理、化學方法進入細胞內(nèi)部，這進一步加大了遺傳轉(zhuǎn)化平臺建立的難度。

Chung等［23］對 C.bescii DSM 6725 的研究取得了突破。菌株C.bescii中一個新的熱穩(wěn)定的限制酶CbeI(Athe_2438)首先被克隆表達并得到深入研究，通過對其酶切位點分析表明，CbeI與限制酶HaeIII是同尾酶(isoschizomer)［23］。進一步分析 C.bescii基因組信息及甲基化實驗驗證，得到了與限制酶CbeI對應(yīng)的DNA甲基化酶M.CbeI(Athe_2437)。在構(gòu)建尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型C.bescii菌株的基礎(chǔ)上，通過電轉(zhuǎn)化的方法實現(xiàn)了菌株的遺傳轉(zhuǎn)化［24］。以上述研究為基礎(chǔ)，C.bescii菌株中的限制酶cbeI基因(Athe_2438)被成功敲除，從而實現(xiàn)了將來源于菌株C.hydrothermalis的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進入C.bescii菌株［25］。

2.5 嗜熱纖維素酶的研究進展

Caldicellulosiruptor屬菌株具有極強的纖維素和半纖維素降解能力，是一個巨大的嗜熱纖維素酶資源庫(表2)。其糖苷水解酶模塊分布于43個家族，種類非常豐富。Caldicellulosiruptor屬的糖苷水解酶大多是具有多結(jié)構(gòu)域的蛋白，它們通常是由1個或2個催化結(jié)構(gòu)域(GH)結(jié)合1個或多個碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBMs)構(gòu)成的，這些與碳水化合物降解相關(guān)的基因，很多在染色體上是成簇存在的。C.saccharolyticus基因組中有2個GH簇在纖維素及半纖維素降解中有著重要作用?；虼谻sac_1076到Csac_1081編碼的CelA-ManA作為纖維素酶起作用;另外一個大的基因簇XynB-XynF(Csac_2404-Csac_2411)編碼胞外或胞內(nèi)蛋白，作用于木聚糖及其側(cè)鏈基團以及 CMC［26］。在 Caldicellulosiruptor屬的8個菌株里面，有一些纖維素酶的ORFs是共有的，屬于17個家族的26個糖苷水解酶(GHs)組成了核心纖維素酶［18］。

C.saccharolyticus中的CelB(Csac_1078)是一個雙功能蛋白，GH5與GH10模塊通過CBM3連接。GH5模塊具有纖維二糖水解酶活性，可以有效地酶解纖維素［27］;GH10具有 CMC 和木聚糖酶活性［26］。C.saccharolyticus中的CelA(Csac_1076)是一個模塊化的酶，GH9與GH48催化結(jié)構(gòu)域通過3個CBM連接，C.bescii菌株中也存在與其同源性非常高的纖維素酶CbCelA。通過克隆構(gòu)建一系列CbCelA截短蛋白，表明CbCel9A為持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶，對不溶性纖維素具有較高活力;CbCbh48A為纖維二糖水解酶;而CBM與熱穩(wěn)定性、漸進性、底物吸附有關(guān)［28］。Cel9B/Man5A［29］和 CbMan5B/Cel44A［30］是C.bescii菌株中的另外2個雙功能纖維素酶，其不同結(jié)構(gòu)域功能都得到了實驗驗證。Caldicellulosiruptor屬菌株基因組中有許多 S-layer蛋白，在Caldicellulosiruptor sp.F32的胞外蛋白中也大量存在［22］。C.saccharolyticus中的 S-layer蛋白 Csac_0678功能得到了驗證，其催化結(jié)構(gòu)域GH5具有內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶活性，而S-layer結(jié)構(gòu)域?qū)H5 催化功能沒有影響［31］。

木聚糖酶是木質(zhì)纖維素降解的另一個關(guān)鍵酶。Caldicellulosiruptor sp.F32具有極強的降解未預處理的小麥秸稈的能力。通過基因組分析，F(xiàn)32具有2個木聚糖酶，分別屬于GH10和GH11家族，系統(tǒng)進化樹如圖3所示。F32中2個熱穩(wěn)定的極端嗜熱木聚糖酶最適溫度在75℃，但二者具有不同的特性，Ying等［32］研究發(fā)現(xiàn)木聚糖酶JX030400比酶活是木聚糖酶JX030401的9倍。另外，通過異源表達發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)32中有許多嗜熱纖維素酶(表3)。如，地衣聚糖酶(KC958563)是一個新的具有專一 β-1，3-1，4-葡聚糖鍵水解特異性的耐熱酶［33］。

圖3 木聚糖酶JX030400和JX030401系統(tǒng)進化樹［32］Fig.3 Phylogenetic tree of JX030400，JX030401 and their closely related gene sequences

表3 來源于F32的嗜熱纖維素酶及半纖維素酶Table 3 Thermostable lignocellulase in strain F32

嗜熱纖維素酶具有熱穩(wěn)定性好、半衰期長等優(yōu)點，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。來源于Fervidobacterium nodosum的FnCel5A是一個嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶，通過對其結(jié)晶結(jié)構(gòu)的分析，馮雁教授課題組對極端嗜熱葡聚糖酶的催化機制及耐熱機制進行了深入研究［34］。以FnCel5A作為催化結(jié)構(gòu)域，進一步建立了對CBM非水解破壞功能的定量方法［35］。

3 結(jié)論及展望

極端嗜熱厭氧菌以其高溫、強纖維素降解能力成為人們的研究熱點。Caldicellulosiruptor屬菌株是嗜熱厭氧菌中的代表，具有豐富的、耐高溫的纖維素酶，能夠提供理論研究或工業(yè)生產(chǎn)中需要的大量酶資源。木質(zhì)纖維素材料具有極強的生物抗屏障性，能夠抵制纖維素酶的降解，尋找高效降解未預處理木質(zhì)纖維素的酶，具有重要的工業(yè)應(yīng)用意義。Caldicellulosiruptor屬菌株具有底物利用范圍廣、能高效降解未預處理的木質(zhì)纖維素、發(fā)酵過程中無碳代謝抑制等優(yōu)點。如何深入探索Caldicellulosiruptor屬菌株嗜熱酶及其高效利用未預處理木質(zhì)纖維素的機制，并對其進行工業(yè)應(yīng)用挖掘，是亟待解決的問題。隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組的研究工作深入，尤其是遺傳轉(zhuǎn)化平臺的建立，為進一步從分子水平上了解和改造嗜熱厭氧菌，促使其成為CBP發(fā)酵細胞工廠平臺系統(tǒng)提供堅實的基礎(chǔ)。

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