周 芳綜述，朱光旭，潘興華審校

血液微小RNA：糖尿病及其并發(fā)癥診斷潛在標記

周 芳1，2綜述，朱光旭1＊，潘興華1＊審校

（1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院干細胞與組織工程中心，云南昆明650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院，云南昆明650500）

糖尿病是一種以空腹血糖升高為主要表現(xiàn)的代謝紊亂性疾病，胰島素生成不足或胰島素抵抗可導(dǎo)致血糖升高，從而引起腎臟、腦血管病變等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。微小RNA（miRNAs）是一種內(nèi)源性短序列非編碼RNA，長約20－22個核苷酸，可通過抑制信使RNA（mRNA）翻譯或誘導(dǎo)靶mRNA降解導(dǎo)致基因沉默，在哺乳動物轉(zhuǎn)錄后的基因表達過程中發(fā)揮重要作用。miRNA在哺乳動物的各個系統(tǒng)中廣泛表達，可調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細胞的功能，且對改變或扭轉(zhuǎn)多種疾病病理生理學(xué)過程中關(guān)鍵調(diào)節(jié)物的表達具有重要作用，其中部分可能成為糖尿病及其并發(fā)癥等多種疾病的新型靶標。血液中存在的miRNA在高溫、反復(fù)凍融等惡劣條件下仍能保持穩(wěn)定，而大多數(shù)RNA都會降解，使得miRNA能夠成為血液基礎(chǔ)的標記物，通過識別其中某些失調(diào)的miRNA可能為糖尿病及其并發(fā)癥的診斷提供新型的靶點方向。

1 miRNA的發(fā)現(xiàn)、成熟與作用機制

1.1miRNA的發(fā)現(xiàn)

miRNA于20世紀90年代早期在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)，這種第一個鑒定的miRNA由基因lin－4表達，能通過抑制基因lin－14的表達而在線蟲發(fā)育進程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，研究證實是由該miRNA可與lin－14的mRNA的3＇非編碼區(qū)獨特的重復(fù)序列反義互補所致。據(jù)估計人類編碼蛋白質(zhì)的基因中60%受miRNA的調(diào)節(jié)，對許多蛋白質(zhì)的表達均具有深遠的影響［1］。雖然距miRNA首次發(fā)現(xiàn)已有20年，但對于miRNA功能及作用機制的了解仍較為有限，已有的文獻顯示miRNA在多種疾病的分化、生長、增殖方面均發(fā)揮了重要調(diào)控作用。

1.2miRNA的成熟及作用機制

miRNA的加工成熟始于核內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的初產(chǎn)物（primary miRNA，pri－miRNA），primiRNA分子量相對較大且包含多個發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，而加工miRNA的微處理器復(fù)合體由核糖核酸酶（ribonuclease，RNaseⅢ）內(nèi)切酶Drosha及RNA綁定蛋白DiGeorge關(guān)鍵區(qū)域8（RNA－binding protein DiGeorge critical region－8，DGCR8）組成，該微處理器復(fù)合體可與pi－miRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)合并且將其加工處理成為miRNA前體（precursor miRNA，pre－miRNA），pre－miRNA大約有70個核苷酸長且有一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在輸出蛋白5的協(xié)同作用下premiRNA經(jīng)過進一步的加工從細胞核內(nèi)輸出進入細胞質(zhì)，可被另一種RNaseⅢ內(nèi)切酶Dicer識別并裂解成為22個核苷酸的雙鏈成熟miRNA，其中一條鏈組裝進RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA－induced silencing complex，RISC），而另一條鏈則被降解［2］。RISC是一個由Argonaute蛋白及成熟miRNA組成的多蛋白復(fù)合體，能夠通過序列互補來識別靶mRNA并與其3’端非編碼區(qū)結(jié)合，如果mRNA與miRNA能夠完全互補，靶mRNA將會直接斷裂，但是如果miRNA與靶mRNA的3’端非編碼區(qū)不完全互補，這時靶mRNA的翻譯則在處理機構(gòu)中被抑制或者被降解，導(dǎo)致基因沉默［3］。如圖1所示。

2 miRNA在糖尿病及其并發(fā)癥診斷中的作用

糖尿病主要包括Ⅰ、Ⅱ兩型，Ⅰ型以胰島β細胞釋放胰島素減少為特征，而Ⅱ型則是由胰島β細胞破壞及胰島素抵抗所致。糖尿病還可引起慢性并發(fā)癥的發(fā)生，多累及各器官的脈管系統(tǒng)，導(dǎo)致腎臟、腦血管病變等的生成。隨著miRNA檢測技術(shù)的發(fā)展，對于miRNA在各種疾病中診斷作用的研究越來越多，Northern印記、定量PCR、微陣列、高通量深度測序等技術(shù)均可對血液中的miRNA進行檢測，方便且無侵入性［4］，因此近年來對血液中一些miRNA在糖尿病及其并發(fā)癥診斷中的應(yīng)用成為了研究的焦點，研究結(jié)果小結(jié)如表1所示。

2.1在Ⅰ型糖尿病診斷中的作用

Ⅰ型糖尿病是一種由胰島β細胞遭受攻擊而介導(dǎo)的常見自身免疫性疾病，多發(fā)生在兒童和青少年。許多研究已證實有多種miRNA參與該病的發(fā)生發(fā)展過程，其在血液中的異常表達可能成為Ⅰ型糖尿病診斷的新突破口［5］。通過對1型糖尿病患者外周血中的調(diào)節(jié)型T細胞（Regulatory T cells，Tregs）分離后進行miRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)，miR－510表達水平顯著增加，miR－342與miR－191則明顯降低，這幾種miRNA異常表達可能影響Tregs的功能，而Tregs是Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)，因此認為miR－510、miR－342與miR－191可能成為Ⅰ型糖尿病診斷的潛在靶點［6］。新近的研究報道在初診的Ⅰ型糖尿病患者的血漿中，miR－21、miR－126、miR－210的表達均有顯著的下調(diào)，提示著Ⅰ型糖尿病的早期發(fā)病，Salas－Pérez F等［7］也在1型糖尿病患者的外周血單核細胞中觀察到miR－21a的下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)它可能參與了T淋巴細胞的調(diào)節(jié)過程，從而可能在Ⅰ型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在對Ⅰ型糖尿病初期患者的血液進行全miRNA序列分析時有文獻報道，miR－25表達明顯的上調(diào)，且與確診為Ⅰ型糖尿病患者的3個月內(nèi)血糖控制情況呈正相關(guān)［8］，可能有助于臨床上對病情的診斷。以上研究證明，miR－510、miR－21、miR－25等miRNA在Ⅰ型糖尿病發(fā)生與發(fā)展過程中表達均有所不同，可能在Ⅰ型糖尿病的早期診斷及病情判斷中具有一定的價值，但這些研究仍處于實驗階段，距應(yīng)用于臨床還需研究者們付出更多的努力。

2.2在Ⅱ型糖尿病診斷中的作用

Ⅱ型糖尿病是一種以胰島素敏感性降低、胰島素抵抗及胰島β細胞破壞為特征的漸進性代謝紊亂性疾病，近年來研究表明血液中許多miRNA在Ⅱ型糖尿病的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，其中一些miRNA對該病有一定的診斷意義［9］。在對Ⅱ型糖尿病患者與健康人血液中的miR－29b、miR－28－3p、miR－15a、miR－233、miR－126五種miRNA進行檢測時發(fā)現(xiàn)，miR－126是唯一的較健康人表達明顯減少的miRNA，并建議將循環(huán)血中的miR－126作為Ⅱ型糖尿病早期診斷的潛在生物學(xué)標記［10］，Liu Y等［11］也得出了相似的結(jié)論，在初診為Ⅱ型糖尿病患者的血清中，miR－126表達顯著減少，同時發(fā)現(xiàn)，在患者經(jīng)過六個月治療后，血清中miR－126的濃度則顯著增加，可能為Ⅱ型糖尿病的早期發(fā)病及治療過程中病情的判斷提供了依據(jù)。有研究報道在新診斷的Ⅱ型糖尿病患者血清中miR29a和miR－375表達皆顯著上調(diào)，且與空腹血糖、餐后2h血糖呈正相關(guān)，證明在Ⅱ型糖尿病早期miR－29a和miR－375在血清中表達失調(diào)，并與血糖控制情況密切關(guān)聯(lián)［12］，此外，在對Ⅱ型糖尿病患者外周血單核細胞中的miRNA水平進行檢測時觀察到，miR－155表達水平明顯下調(diào)，且與糖化血紅蛋白、葡萄糖、體重指數(shù)呈相關(guān)關(guān)系［13］，因此認為miR－29a、miR－375、miR－155等miRNA可能在Ⅱ型糖尿病的早期發(fā)病及治療過程對病情的監(jiān)測方面具有重要價值，有希望成為未來Ⅱ型糖尿病的診斷靶點，然而仍沒有尋找到具有特異性診斷作用的miRNA，今后應(yīng)側(cè)重于對該種miRNA在疾病診斷中的研究。

2.3在糖尿病并發(fā)癥診斷中的作用

文獻顯示在糖尿病并發(fā)癥未出現(xiàn)臨床癥狀之前，血液中某些失調(diào)的miRNA即可優(yōu)先對其進行早期診斷，大大的改善了糖尿病患者生活質(zhì)量［14］，因此近年來篩選對糖尿病并發(fā)癥具有診斷作用的血液miRNA成為了研究的熱點。以下便列舉一些可能在糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）、缺血性中風等糖尿病并發(fā)癥中具有診斷意義的血液miRNA。

圖1 miRNA的成熟過程及作用機制［18］

表1 血液miRNA在糖尿病及其并發(fā)癥中的表達情況

在對DN患者的血清miRNA經(jīng)實時定量PCR檢測后研究觀察到，miR－135a表達水平有顯著的上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miR－135a在DN患者腎纖維化過程中發(fā)揮了重要作用，這與Ⅱ型糖尿病小鼠模型組織中檢測的結(jié)果一致，可能成為DN病情診斷的潛在靶點［15］。血液中miRNA除了在DN診斷中發(fā)揮重要作用以外，在糖尿病其他并發(fā)癥的診斷方面同樣具有重大意義，如在糖尿病伴缺血性中風患者的血漿及血小板中的miRNA表達情況檢測中顯示，miR－233與miR－146a明顯下調(diào)，提示miR－233與miR－146a的表達減低是糖尿病繼發(fā)缺血性中風的一個危險因素，可能為臨床上對糖尿病性缺血性中風的診斷提供依據(jù)［16］；而在糖尿病并發(fā)嚴重肢體缺血的患者血清中也發(fā)現(xiàn)miR－15a與miR－16表達的增加，并且與經(jīng)血管再通術(shù)12個月后的再狹窄情況呈正比例關(guān)系，因此血清中的miR－15a與miR－16可能成為糖尿病并發(fā)嚴重肢體缺血術(shù)后診斷的預(yù)測性生物學(xué)標記［17］。綜上所述，miR－135a、miR－233、miR－15a等多種血液miRNA在糖尿病并發(fā)癥的早期及術(shù)后診斷過程中發(fā)揮重要作用，可能成為其診斷的潛在靶標，但目前研究主要為組織細胞中miRNA在糖尿病并發(fā)癥診斷中的應(yīng)用，血液中miRNA的較少，因此以后應(yīng)注重血液miRNA在該病診斷中的應(yīng)用研究。

3 小結(jié)

雖然近年來對miRNA生物學(xué)活性的研究越來越多，但關(guān)于血液miRNA在疾病狀態(tài)下發(fā)揮診斷作用的報道甚少。血液中一些miRNA可能在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，有望成為其潛在的生物學(xué)標記，但是迄今仍然沒有尋找到具有特異性診斷作用的miRNA，只能根據(jù)已有的數(shù)據(jù)推測，認為某些血液miRNA可能對糖尿病及其并發(fā)癥的早期及病情判斷具有一定的診斷價值。因此，深入揭示血液miRNA在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中的病理生理學(xué)意義，尋找特異性診斷作用的miRNA，將是今后開展針對血液miRNA與糖尿病及其并發(fā)癥研究的重要內(nèi)容。

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周芳（1990－），女，在讀碩士研究生，主要從事臨床實驗診斷研究；潘興華，男，主任醫(yī)師，研究方向為干細胞與組織工程。

2014－08－17）

1007－4287（2014）12－2080－04

國家自然科學(xué)基金項目（81170316）

＊通訊作者