叢 蔚，吳曉明，徐進(jìn)宜

中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室 藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，南京 210009

拓?fù)洚悩?gòu)酶 1（Topoisomerase，Top1）是一種廣泛存在于生物體（真核細(xì)胞、原核細(xì)胞）中，參與調(diào)節(jié)DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的核酶。DNA在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的時候，雙螺旋打開成為平行的兩條單鏈，兩條DNA單鏈各自雙螺旋化和折疊成為兩套染色體的過程中Top1都起到?jīng)Q定性作用[1]。因此Top1成為一個良好的藥物作用靶點。在正常生理狀態(tài)下，由Top1導(dǎo)致的DNA斷裂是瞬時的，斷裂后的再連接速度非?？?。通過設(shè)計抑制劑插入Top1-DNA斷裂復(fù)合物（Top1cc）中，使DNA由瞬時斷裂變?yōu)橛谰脭嗔?，從而使?xì)胞死亡[2]。

喜樹堿是發(fā)現(xiàn)的首個Top1抑制劑，通過可逆地與Top1cc形成三元復(fù)合物而導(dǎo)致DNA斷裂[3]。目前針對喜樹堿的改造已經(jīng)比較全面，很難有太大的突破。而喜樹堿很多固有缺陷（來源、與Top1cc結(jié)合強度、耐藥等）也并沒有得到根本解決，因此研發(fā)非喜樹堿類Top1抑制劑抗腫瘤新藥成為共識[4]。經(jīng)過幾十年的努力，科學(xué)家研發(fā)了眾多非喜樹堿Top1抑制劑，其中茚并異喹啉酮類最為典型代表。本文對茚并異喹啉酮類的發(fā)展歷程和改造策略進(jìn)行詳細(xì)地綜述。

1 茚并異喹啉酮類先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)（1998年）

1978年，Cushman小組[5]在合成氯化兩面針堿時，意外地發(fā)現(xiàn)一個具有茚并異喹啉酮結(jié)構(gòu)的副產(chǎn)物1（見圖1），但當(dāng)時并沒有引起他的重視。直到將近20年之后，Cushman的藥理合作者Pommier小組[6]發(fā)現(xiàn)1具有較強的抗增殖活性（平均半抑制濃度MGM=8.5 μmol·L-1）和中等的 Top1抑制活性，并將其命名為NSC 314622。

通過充分的藥理實驗證明，以NSC 314622（1）為代表的茚并異喹啉酮類相對于喜樹堿具有以下優(yōu)點[7]：①通過人工合成得到，相對廉價易得；②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；③插入Top1-DNA復(fù)合物的位點與喜樹堿不同，因此抗腫瘤譜與喜樹堿不同；④與Top1-DNA形成的三元復(fù)合物更加穩(wěn)定，藥物作用時間更長；⑤基本不會成為腫瘤過度表達(dá)的藥物外排泵（ABCG2和MDR-1）的底物，從而有希望抵抗拓?fù)涮婵?、伊立替康耐藥和多藥耐藥?/p>

圖1 茚并異喹啉酮先導(dǎo)物NSC 314622（1）

NSC 314622（1）是第一個進(jìn)入臨床的茚并異喹啉酮類Top1抑制劑[6]。但遺憾的是，因為其抗腫瘤活性不佳而終止于Ⅰ期臨床。1998年以來，Cushman小組針對NSC 314622（1）進(jìn)行了系統(tǒng)地優(yōu)化改造，得到了超過400個衍生物，經(jīng)過藥理活性篩選得到許多優(yōu)良的Top1抑制劑。

2 側(cè)鏈取代基的初步優(yōu)化（1998～2006年）

由于茚并異喹啉酮結(jié)構(gòu)新穎，沒有可參考的經(jīng)驗，因此只能針對其結(jié)構(gòu)逐一優(yōu)化探索。先導(dǎo)物NSC 314622（1）由ABCD四個環(huán)構(gòu)成（見圖1）：A環(huán)和D環(huán)均為苯環(huán)，分別含有2，3-二甲氧基和8，9-亞甲二氧基取代；B環(huán)為6元內(nèi)酰胺環(huán)，6位N上有甲基取代；C環(huán)是含有酮羰基的五元環(huán)。因此初步優(yōu)化也是針對ABCD環(huán)及其取代基開展。同時，Cushman小組針對Top1抑制活性建立了自己的評價體系（見表1）[8]。

2.1 N上取代基的修飾

C環(huán)上6位N上取代基是合成過程中最后引入的，因此最容易修飾。將甲基換為更長的疏水（乙基、丁基等）或親水（羥基、氨基等）側(cè)鏈發(fā)現(xiàn)，N上取代基對于抗增殖和Top1抑制活性至關(guān)重要，親水側(cè)鏈明顯優(yōu)于疏水側(cè)鏈（見圖2）[8]。改變側(cè)鏈上氮原子或氧原子分布發(fā)現(xiàn)，側(cè)鏈上氮原子與酰胺氮距離3個碳原子最優(yōu)[9]，如3-氨基丙基或者3-（2-羥乙基胺基）丙基（化合物 4）。 其中后者的 GI50可以達(dá)到 0.21 μmol·L-1，與喜樹堿類似（++++）[8]。該化合物又被命名為MJ-Ⅲ-65或NSC 706744，并后續(xù)開展了詳細(xì)的臨床前實驗[10]。進(jìn)一步將側(cè)鏈上的直鏈胺變?yōu)榄h(huán)狀胺，得到連有咪唑的化合物5（LMP776，Indotecan） 和連有嗎啉的化合物 6（LMP400，Indimitecan）[11]。這兩個化合物具有良好的抗增殖和Top1抑制活性，而對其他靶點幾乎沒有作用，因此在2010年進(jìn)入Ⅰ期臨床研究，用于治療成人復(fù)發(fā)的各種實體瘤和淋巴瘤[12]。

表1 Top1抑制活性的評價體系

圖2 N上取代基的修飾

2.2 A環(huán)和D環(huán)含氧取代基

最初發(fā)現(xiàn)2、3位和8、9位含氧取代可增強抗增殖活性，幾個活性很好的化合物均具有含氧取代基（見圖2）[9-12]。后續(xù)詳盡的研究表明[13-14]：①對于活性而言，含氧取代基（尤其是D環(huán)）只提供一小部分貢獻(xiàn)；②含有甲氧基或者亞甲二氧基取代使藥物成為O-脫甲基酶的作用底物，從而易于代謝；③反之，不含氧取代的母核可以提高藥物代謝穩(wěn)定性；④母核上無取代基的茚并異喹啉酮類還有可能作為DNA插入劑而直接作用于DNA，當(dāng)DNA被其插入后，Top1將無法與DNA結(jié)合，也起到抑制DNA功能的作用。

從代謝物中尋找新藥是一條捷徑，Cushman小組也將這種方法用在茚并異喹啉酮的研究中 （見圖3）。2012年，Cushman 小組報道了 LMP776（5）和 LMP400（6）在體內(nèi)代謝物的研究，發(fā)現(xiàn)3-脫甲基得到的3-羥基取代產(chǎn)物（7和8，圖3a）活性比原藥更好[14]。同樣人工合成的其他代謝類似物（9和10，圖3b）也顯示出優(yōu)良的活性，提示含氧取代母核在體內(nèi)可能作用更持久。因此對于AD環(huán)的含氧取代基的取舍需要從整體的成藥性考慮。

2.3 C環(huán)和D環(huán)修飾

圖 3 LMP776（5）和 LMP400（6）體內(nèi)的脫甲基代謝物

對先導(dǎo)化合物NSC314622（1）進(jìn)行C環(huán)和D環(huán)修飾時，發(fā)現(xiàn)如下規(guī)律：①C環(huán)11位酮羰基還原得到11，活性明顯下降（見圖4a），驗證了酮羰基是一個關(guān)鍵的氫鍵結(jié)合位點[9]；②將BC環(huán)之間的雙鍵還原得到12，抗增殖活性增強，但Top1抑制活性喪失（圖4b），可能由于該雙鍵維持骨架平面性起關(guān)鍵作用[15]；③將C環(huán)酮羰基通過McMurry反應(yīng)引入11-烯烴長鏈，末端帶有3-氨基取代的化合物得到的13活性最好（圖 4c）[16]，但并沒有超過之前報道的化合物[9，12]；④將 D 環(huán)由苯環(huán)換為萘環(huán)得到14，雖然抗增殖活性比先導(dǎo)物強，但是Top1抑制活性明顯下降（圖4d）[9]，可能由于過大的平面體系不利于堿基對的插入以及與Top1的氫鍵結(jié)合。

圖4 C環(huán)和D環(huán)的修飾

總之，在最初階段的修飾中，Cushman小組確證了茚并異喹啉酮母核的關(guān)鍵作用，后續(xù)深入的修飾主要是在6位N取代基和AD環(huán)上開展。

3 雙茚并異喹啉酮類二元插入劑 （2003～2006年）

多胺（Ployamines，PA）是一種廣泛存在的胺類，多胺在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子化后帶正電荷，與帶負(fù)電荷的DNA磷酸基團(tuán)或者蛋白質(zhì)作用，從而調(diào)控DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的功能[17]。此外，細(xì)胞膜上廣泛存在多胺轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)（polyamine transporter system），因此含有多胺結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物更容易被高多胺需求的腫瘤細(xì)胞攝取[17]。

基于上述理論，Cushman小組在母核6位發(fā)展了一類長鏈多胺取代基（圖5）。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)[18]：①第一個氮原子與酰胺氮距離3個碳原子最優(yōu)；②側(cè)鏈上氮原子之間間隔2個碳原子最優(yōu)；③Top1抑制活性并不隨氮原子的數(shù)目增加而增強，當(dāng)?shù)訑?shù)增加到4（17，圖5b），Top1抑制活性喪失。經(jīng)篩選得到的側(cè)鏈含3個氮原子的化合物15（GI50=2.4 μmol·L-1，++++；圖5a）雖然活性與之前報道的最優(yōu)化合物相似，但是由于側(cè)鏈上三個銨鹽的存在，水溶性大大提高。

圖5 多胺側(cè)鏈

圖6 雙茚并異喹啉酮類

4 母核電子云分布對于活性的影響（2006～2013年）

2006年[20]至2007年[21-22]，Cushman小組繼續(xù)針對AD環(huán)取代基開展研究，發(fā)現(xiàn)（圖7）：將A環(huán)供電子的3，4-二甲氧基替換為3-硝基取代后，抗增殖活性顯著增強，Top1抑制活性得到保持；而D環(huán)只保留9位甲氧基（19）可以使活性得到最優(yōu)，將其換為氟或溴之后（20和21），抗增殖活性略微降低，替換為體積更大的苯基（22），Top1抑制活性喪失。再對6位側(cè)鏈的優(yōu)化同樣發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈氮原子與母核間隔3個碳原子最好 （23～26）。上述幾個最優(yōu)化合物的活性均超過已發(fā)現(xiàn)的所有化合物，而其共有的結(jié)構(gòu)說明3-硝基-9-甲氧基取代至關(guān)重要。

圖7 9位取代基的優(yōu)化

在喜樹堿的改造經(jīng)驗中，14位引入氮原子可增加水溶性[23]。2011年以來，Cushman小組也將這個經(jīng)驗應(yīng)用到茚并異喹啉酮母核的改造上[24-26]，在D環(huán)上引入氮原子，使水溶性提高一倍至幾十倍不等，而活性保持（圖8a）[24]。繼續(xù)比較D環(huán)上氮原子位置和甲氧基取代對活性的影響，發(fā)現(xiàn)7位氮雜、9位甲氧基取代最佳（圖8b）[25]。最終對6位側(cè)鏈進(jìn)行優(yōu)化，側(cè)鏈末端為咪唑時得到化合物 30（GI50=0.021 μmol·L-1，+++++）[26]?；衔?0不僅抗增殖和Top1抑制活性突出，還展示出非常良好的藥代動力學(xué)特性和抗耐藥特性：在針對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的測試中，30與Top1cc可以穩(wěn)定持續(xù)6 h；即使在藥物去除后，細(xì)胞仍然被阻滯在S期長達(dá)3 h；30不是藥物外排泵ABCB1的底物；對于幾種喜樹堿耐藥的腫瘤株（KBV.1/Vinbl和 H460/Mito）依然有效[26]。 總之，化合物30是一個非常優(yōu)良的Top1抑制劑。

圖8 D環(huán)和側(cè)鏈的修飾

從前面對茚并異喹啉酮的修飾過程中可以看出，母核是Top1抑制活性的決定因素。為什么具有3-硝基-7-氮雜-9-甲氧基取代的母核能展示出這么好的活性？Cushman小組發(fā)現(xiàn)，除了氫鍵作用之外，更深層的因素來自于母核的電子云分布[27]。因為母核需要插入Top1cc復(fù)合物中，實際是插入相鄰兩組DNA的堿基對中，所以保持母核平面性是第一個關(guān)鍵因素（反之，將BC環(huán)間雙鍵還原導(dǎo)致Top1抑制活性消失[15]）。

通過計算機模擬，Cushman小組得出如下結(jié)論[27]：①母核與相鄰兩組堿基對的π-π堆積作用在決定結(jié)合取向上起重要影響；②在結(jié)合取向確定后，母核與相鄰兩組堿基對產(chǎn)生靜電互補作用，這種靜電吸引力對于穩(wěn)定Top1cc起關(guān)鍵作用；③母核與相鄰兩組堿基對也可能形成電荷轉(zhuǎn)移相互作用，對于穩(wěn)定結(jié)合力度也起重要作用。所以針對堿基的電子云分布，設(shè)計與之電子云互補的母核是提高活性的關(guān)鍵所在。

有了上述的理論支持就很容易解釋為什么強吸電的3-硝基和強供電的3-甲氧基取代都對活性有所貢獻(xiàn)，但硝基更好[20-22]：3位富電子的基團(tuán)與鄰近缺電子的堿基邊緣可以形成靜電互補作用；而硝基和甲氧基都是富電子基團(tuán)，但顯然硝基電子云密度更高；此外，硝基的吸電作用使整個母核缺電子，也可以與富電子的堿基母核形成靜電互補作用。而D環(huán)的7位氮雜、9位甲氧基取代更優(yōu)的道理與之類似[24-26]。另外，將硝基還原為氨基發(fā)現(xiàn)Top1抑制活性喪失，也是因為氨基不具備硝基的特性所導(dǎo)致[20]。

5 糖鏈的引入（2011年至今）

在另一類非喜樹堿Top1抑制劑吲哚咔唑類改造中，吡喃糖側(cè)鏈?zhǔn)腔钚员匦杌鶊F(tuán)（見圖9）[1]。構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，吲哚咔唑類的糖側(cè)鏈與茚并異喹啉酮6位側(cè)鏈處于與Top1氫鍵結(jié)合的同一位點[28]。此外，含糖側(cè)鏈具有很多優(yōu)點[28-29]：①水溶性好；②糖側(cè)鏈可與Top1的氨基酸殘基形成更強的氫鍵作用，從而有可能增強活性；③腫瘤細(xì)胞膜上過度表達(dá)的葡萄糖轉(zhuǎn)運體會使含糖的茚并異喹啉酮更加選擇性地被吸收。基于以上優(yōu)點，Cushman小組采用 “平臺躍遷”（platform hop）的策略將吲哚咔唑類的糖鏈引入到茚并異喹啉酮中。

圖9 引入糖側(cè)鏈的設(shè)計思想

對含有3、5、6個碳的直鏈糖、吡喃糖等（圖10）化合物的篩選過程中進(jìn)一步證明，A環(huán)3-硝基取代優(yōu)于含氧取代；C3、C5直鏈糖的抑制率明顯優(yōu)于 C6（31、32優(yōu)于33）；在吲哚咔唑類中最優(yōu)的β-吡喃葡萄糖基，在茚并異喹啉酮中卻很差（34）[29]。經(jīng)過篩選得到了十幾個活性非常好的化合物（GI50＜5 μmol·L-1，Top1 抑制≥++++），初步達(dá)到了此次設(shè)計的目標(biāo)。

含糖側(cè)鏈的茚并異喹啉酮的合成難度明顯高于以往的化合物，但它基本指明了后續(xù)的研究方向，包括[29]：①在母核上引入之前證明強效的取代基，如3-硝基-7-氮雜-9-甲氧基等；②進(jìn)一步篩選環(huán)狀糖和氨基糖等。

6 Top1/Tdp1雙重抑制劑（2012年至今）

圖10 糖鏈長度優(yōu)化

Top1與DNA作用形成斷裂復(fù)合物Top1cc后，自然情況下會瞬時恢復(fù)。自然原因或者Top1抑制劑導(dǎo)致的Top1cc阻滯，主要存在兩條修復(fù)途徑。第一條途徑通過如下步驟完成[1，3]（圖11a）：①由于DNA被Top1緊緊包裹，泛素-蛋白酶體會先將Top1大部分降解，而只留下與DNA共價結(jié)合的部分；②酪氨酰磷酸酯酶 1（Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1，Tdp1）會將Top1殘余的酪氨酸-磷酸酯鍵水解，從而釋放出DNA的3′-磷酸末端；③多核苷酸激酶磷酸酯酶（PNK）繼續(xù)將末端的磷酸去除，從而使3′-羥基游離；④DNA聚合酶和連接酶最后將斷開的3′-羥基連接至5′-磷酸，從而完成修復(fù)。第二條途徑相對簡捷（圖11b）：正常細(xì)胞還可以通過檢查點激酶（Chk1，2）介導(dǎo)的3′-核苷酸內(nèi)切酶旁路，將與Top1相連的一段DNA切除，再通過DNA聚合酶和連接酶完成修復(fù)[1，3]。

圖11 Top1-DNA復(fù)合物阻滯修復(fù)途徑

腫瘤細(xì)胞正是由于檢查點激酶等抑癌因素缺失才發(fā)生癌變，所以第二條途徑是腫瘤細(xì)胞的先天缺陷（圖12b）[30]。當(dāng)Top1抑制劑導(dǎo)致Top1-DNA復(fù)合物阻滯時，腫瘤細(xì)胞只能依賴第一條途徑完成修復(fù)，而其中的Tdp1是完成修復(fù)的關(guān)鍵酶，因此設(shè)計Tdp1抑制劑可以增強Top1的抑制作用。理論上，Tdp1抑制劑對人體正常細(xì)胞毒副作用很小，因為人體細(xì)胞可以通過多條途徑完成修復(fù)（圖12a）[30]。因此，Tdp1抑制劑是抗腫瘤的理想靶點。

圖12 正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞修復(fù)途徑對比

Tdp1的作用底物為磷酸酯鍵，因此Tdp1抑制劑的設(shè)計思路是利用藥物模擬磷酸基團(tuán)的作用，與Tdp1結(jié)合而妨礙其催化[30]。Cushman小組基于上述設(shè)計思想，開展Top1/Tdp1雙重抑制劑的研究。最初，將6位連有長鏈伯胺的化合物進(jìn)行了Tdp1抑制活性的篩選（35～37，圖13a），盡管它們 Top1抑制活性很差，但其Tdp1抑制活性較好，這表明該類化合物可成為Tdp1抑制劑[31]。文獻(xiàn)報道[32]磺酸基團(tuán)可以模擬磷酸與Tdp1結(jié)合，是活性必需基團(tuán)。因此Cushman小組合成了數(shù)十個連有磺酰胺、磺酸酯的化合物。但令人遺憾的是，以化合物40為代表的磺酰胺類，雖然抗增殖和Top1抑制活性很強（GI50=0.046 μmol·L-1，++++；圖 13c），但 Tdp1 抑制活性都很差（IC50＞111 μmol·L-1）。 反而是未經(jīng)磺?；?6 位末端為伯胺基的化合物（38和39，圖 13b）具有中等的 Tdp1抑制活性，Top1抑制活性也比較好（+++）[31]。此外，在篩選之前報道的雙茚并異喹啉酮類化合物時意外發(fā)現(xiàn)化合物18（圖13d）具有很強的 Tdp1 抑制活性（IC50=1.52 μmol·L-1）[31]。 但該化合物可直接作用于DNA，因此Tdp1抑制活性數(shù)據(jù)可能不準(zhǔn)確。綜上所述，對于茚并異喹啉酮母核，6位含有3-氨基取代是Tdp1抑制活性的必需基團(tuán)。

與磺酸類似，羧酸同樣可以模擬磷酸基團(tuán)與Tdp1結(jié)合。Cushman小組嘗試將羧酸引入茚并異喹啉酮的3位（圖14）?；衔?41 雖然具備較強 Tdp1 抑制活性（GI50=5.0 μmol·L-1），但是Top1抑制作用消失，可見同時具備兩種抑制活性是非常困難的[32]。Cushman小組又將前述具有6位3-氨基取代的化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了幾個同時具備較強Tdp1/Top1抑制的化合物19、42[33]和3-氨基取代的43。

圖13 茚并異喹啉酮類Tdp1抑制活性的初步探索

圖14 AD環(huán)取代基的優(yōu)化

上述化合物的發(fā)現(xiàn)具有重大意義[31，33]：①確證茚并異喹啉酮類可以發(fā)展成為Top1/Tdp1雙重抑制劑，這也是首次發(fā)現(xiàn)的小分子雙重抑制劑；②茚并異喹啉酮類母核可以為后續(xù)的修飾提供廣闊空間，這是其他Tdp1抑制劑所不具備的；③茚并異喹啉酮有可能與Tdp1形成共結(jié)晶，從而為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計提供依據(jù)。但是也應(yīng)該認(rèn)識到，在上述研究中，Top1、Tdp1和抗增殖活性三者關(guān)聯(lián)并不緊密，因此，還不能得出由于Tdp1被抑制而導(dǎo)致Top1造成的抗增殖活性增強的結(jié)論。故研發(fā)Top1/Tdp1雙重抑制劑還需要繼續(xù)探索。

7 由茚并異喹啉酮類到吲哚并喹啉類

受Mark Cushman小組研發(fā)茚并異喹啉酮類的啟發(fā)，我們課題組在其基礎(chǔ)上，嘗試將茚并異喹啉酮類與喜樹堿“雜交”（見圖15）：即保留喜樹堿的喹啉環(huán)，而將茚并異喹啉酮的異喹啉酮環(huán)簡化為吲哚環(huán)，從而設(shè)計了一類與之完全不同而功能相似的吲哚并喹啉母核。吲哚并喹啉類結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于合成和修飾，而目前尚無此類母核的Top1抑制活性的報道，具有較強的新穎性。初步的藥理活性評價表明，吲哚并喹啉類化合物具有良好的抗增殖活性（GI50＜5 μmol·L-1），是非常有希望的抗腫瘤化合物。更加深入的藥理活性測試目前正在進(jìn)行之中。

圖15 吲哚并喹啉類的設(shè)計思想

8 總結(jié)與展望

Mark Cushman小組在最近15年的研究中，以NSC 314622（1）為先導(dǎo)化合物，合成了超過400個衍生物，其中有數(shù)十個活性優(yōu)良的Top1抑制劑。最引人注目的是化合物NSC 314622 （1）、Indotecan （5，LMP776） 和 Indimitecan（6，LMP400）先后進(jìn)入I期臨床研究。Cushman小組在對先導(dǎo)化合物優(yōu)化過程中，綜合運用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計的理念，結(jié)合計算機輔助藥物設(shè)計，加以生物電子等排、前藥、代謝物研究等策略，展示了從一個先導(dǎo)化合物到一個茚并異喹啉酮衍生物家族的發(fā)展歷程?？梢灶A(yù)見，未來會有活性更好、成藥性更優(yōu)的茚并異喹啉酮類Top1抑制劑或Top1/Tdp1雙重抑制劑被開發(fā)出來。茚并異喹啉酮類的發(fā)展歷程為其他非喜樹堿類Top1抑制劑的研究提供了可借鑒的經(jīng)驗。

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