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      豬流行性腹瀉病毒TaqMan熒光定量RT—PCR檢測方法的建立

      2014-05-18 06:10:50劉自立董雅琴于美芳吳發(fā)興邵衛(wèi)星李曉成王樹雙
      中國動物檢疫 2014年4期
      關(guān)鍵詞:重復(fù)性探針定量

      張 志,劉自立,董雅琴,于美芳,劉 爽,吳發(fā)興,邵衛(wèi)星,李曉成,王樹雙

      (1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東 青島 266032;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南 昆明 650201)

      豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是一種以豬腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征的急性高度接觸性腸道傳染病[1],此病多發(fā)于冬季12月至來年2月寒冬季節(jié),在夏季也可發(fā)生,尤其哺乳仔豬受害最嚴(yán)重。新生仔豬PED潛伏期為24~36小時。病豬表現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水,年齡越小,癥狀越重,其病原是豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。該病毒最早分離于比利時表現(xiàn)腹瀉的豬群,并命名為類冠狀病毒CV777株,而后英國、匈牙利、德國、加拿大、日本、韓國等相繼報道本病的發(fā)生[2]。我國自上世紀(jì)80年代初開始陸續(xù)發(fā)生PED,特別是最近3年以來,PED已成為最重要的豬群疫病,不僅感染面廣,而且發(fā)病率和死亡率都居高不下,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。鑒于PED和豬傳染性胃腸炎在臨床上很難區(qū)別,而且PEDV又難以在細(xì)胞上增殖和培養(yǎng),所以,早期診斷對本病的防治具有極其重要的意義,因此建立一種快速,高靈敏度的診斷方法勢在必行。PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬,病毒粒子核酸為線性正股單鏈RNA,整個基因組長約28.6kb,含有4種結(jié)構(gòu)蛋白:S蛋白(spike protein)、sM蛋白(small membrane protein)、M蛋白(membrane protein)和N蛋白(nucleoprotein)。其中N基因?yàn)楹说鞍祝匦员容^保守和穩(wěn)定,因此常作為檢測PEDV的候選基因區(qū)域。本文利用熒光定量PCR具有準(zhǔn)確定量、高敏感性和高特異性等優(yōu)點(diǎn),針對PEDV比較保守的N基因區(qū)域設(shè)計了一個TaqMan探針,建立了一套快速檢測PEDV的熒光定量RT—PCR檢測方法,并在實(shí)際應(yīng)用中得以驗(yàn)證。

      1 材料與方法

      1.1 病毒

      豬流行性腹瀉病毒(DR13)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬傳染性胃腸炎(TGEV)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

      1.2 儀器與試劑

      質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司,Trizol購自invitrogen公司,pMD-18-T載體、One-step反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自法連寶生物工程有限公司。檢測用儀器主要有Bio-Rad熒光定量PCR儀和eppendorf核酸蛋白分析儀。

      1.3 引物與探針

      根據(jù)PEDV參考毒株JX088695的 N基因設(shè)計引物和TaqMan探針,目的片段 122bp。熒光探針序列為 PEDVP:5’-GTTGCCATTACCACGACTCCTGCTAC -3’(26846-26821),探針的5’端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM,3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA,上游和下游引物分別為PEDV-F:5’-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3’(26760-26782) 和 PEDV-R:5’-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT - 3’(26881-26858),引物和探針均由大連寶生物工程有限公司合成。

      1.4 病毒RNA提取

      按照Trizol說明書從PEDV等病毒接種的細(xì)胞培養(yǎng)物或組織提取總RNA,于-70℃保存。

      1.5 反應(yīng)體系

      熒光RT—PCR的反應(yīng)采用一步法進(jìn)行,用矩陣法對熒光定量PCR的引物濃度、探針濃度進(jìn)行篩選優(yōu)化,以得到最佳的熒光定量PCR反應(yīng)條件。

      1.6 標(biāo)準(zhǔn)品制備

      將PEDV目的片段克隆到pMD18-T載體轉(zhuǎn)化到DH5α中,搖菌提取質(zhì)粒,經(jīng)鑒定正確后,測定質(zhì)粒OD260值,并換算質(zhì)粒濃度(copies/μL),并放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

      1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

      將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋,從10-1到10-9,以此作為模板在熒光定量PCR儀上檢測,得出各自的熒光曲線,儀器軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.8 敏感性試驗(yàn)

      將陽性質(zhì)粒10倍梯度稀釋,從10-1到10-9,以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR和常規(guī)RT—PCR檢測,比較二者將所能檢測出的最低拷貝數(shù)以確定熒光定量PCR的靈敏度。

      1.9 特異性試驗(yàn)

      分別提取CSFV、PRRSV、PCV2和TGEV的病毒核酸,在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測,觀察PEDV熒光PCR是否可以同時檢測到其他病毒,以確定其特異性。

      1.10 重復(fù)性試驗(yàn)

      對來自貴州、四川的表現(xiàn)腹瀉癥狀的腸道組織樣和豬流行性腹瀉病毒細(xì)胞培養(yǎng)物分別用熒光定量RT—PCR方法進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn),批內(nèi)試驗(yàn)時每個樣品設(shè)置3個重復(fù),批間試驗(yàn)在第1,2和3天對樣品進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

      1.11 樣品檢測

      對河北、廣西、貴州、四川等地豬場送檢的糞便和腸道病料進(jìn)行處理,提取RNA,用建立的熒光定量RT—PCR進(jìn)行檢測,同時與常規(guī)PEDV 的RT—PCR方法進(jìn)行比較。

      2 結(jié)果

      2.1 熒光定量RT—PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

      綜合考慮反應(yīng)體積、反應(yīng)成本和反應(yīng)效率,最終將反應(yīng)體系定位25μL,其中含有2×1 step Buffer 12.5μL,引物各1μL,探針0.5μL,RNA模板 3μL,酶混合物(含反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶)1μL,RNase-Free H2O 6μL。引物、探針終濃度為0.4μmol/L、0.2μmol/L。擴(kuò)增條件為:42℃反轉(zhuǎn)錄5 min;95℃預(yù)變性3 min;40個擴(kuò)增循環(huán)(95℃15s、60℃ 30s)。

      2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

      如圖1A所示,模板濃度為2.61×108、2.61×107、2.61×106、2.61×105、2.61×104、2.61×103、2.61×102、2.61×101拷貝 /μL 的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光RT—PCR曲線。它們的循環(huán)閾值分別 為 14.65,16.31,19.17,22.14,26.56,30.17,33.23,35.27。將這些數(shù)據(jù)分析后生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,詳見圖1B,其中,y軸為循環(huán)閾值,x軸為質(zhì)粒樣品的拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.171,截距為43.450,R2為0.990,E=106.7%。

      圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的熒光RT—PCR動力學(xué)擴(kuò)增和斜率曲線

      2.3 敏感性試驗(yàn)

      如表2所示,熒光定量RT—PCR能檢測出的模板最低濃度為2.61×101拷貝/μL,而常規(guī)RT—PCR(表1)的檢測極限是2.61×104拷貝/μL,這說明熒光定量RT—PCR 的敏感性比常規(guī)RT—PCR 的敏感性高1000倍。

      表1 熒光定量RT—PCR和普通RT—PCR的敏感性試驗(yàn)

      2.4 特異性試驗(yàn)

      分別用PEDV、CSFV、PRRSV、PCV2和TGEV等四種不同病毒分別提取核酸,并進(jìn)行熒光定量RT—PCR,結(jié)果只有PEDV呈現(xiàn)明顯的“S”形陽性擴(kuò)增曲線,其余病毒均未擴(kuò)增出(詳見圖2),表明建立的熒光定量RT—PCR試驗(yàn)方法具有良好的特異性。

      圖2 PEDV熒光定量RT—PCR方法的特異性試驗(yàn)

      2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

      為證實(shí)PEDV的穩(wěn)定性,對部分病料和疫苗分別進(jìn)行了3批批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn),結(jié)果表明(表2),批內(nèi)變異系數(shù)平均為0.84%±0.35,批間變異系數(shù)平均為1.55%±0.74,表明本檢測方法的重復(fù)性良好。

      2.6 現(xiàn)地樣品檢測

      對地方豬場送檢的43份糞便病料進(jìn)行了熒光定量RT—PCR檢測,同時與常規(guī)RT—PCR方法相比較,結(jié)果如表3。在43份待檢病料中,熒光定量RT—PCR方法檢出28份為陽性,常規(guī)RT—PCR 方法檢出12份為陽性,這表明熒光定量RT—PCR檢測的敏感性明顯高于常規(guī)RT—PCR方法。其中,河北、貴州等多省份送檢的病料中均可以檢測到PEDV,也進(jìn)一步說明PEDV的感染面已經(jīng)非常廣泛。

      表2 熒光定量RT—PCR方法的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

      表3 現(xiàn)地樣品的熒光定量RT—PCR 和常規(guī) RT—PCR檢測

      3 討論

      熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)過程中不斷連續(xù)監(jiān)測熒光信號來測定特異性產(chǎn)物的量,并以此來推斷目的基因的初始量,它綜合了PCR技術(shù)、激光技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)等于一體,所以具有很高的靈敏度,逐漸成為動物疫病檢測的必備方法。根據(jù)采用的熒光材料不同可以分為SYBR Green I染料法、TaqMan探針法、分子信標(biāo)法等。SYBR Green I染料與任何雙鏈DNA都能結(jié)合,易產(chǎn)生非特異性熒光,而TaqMan探針法對目的序列有較高特異性且與分子信標(biāo)法相比設(shè)計簡單,重復(fù)性好,因此被普遍使用。

      PEDV的多種檢測方法中,分子生物學(xué)方法已經(jīng)成為最常用的方法,陸續(xù)建立了一些PEDV的RT—PCR、套式RT—PCR、與TGEV和A型輪狀病毒等鑒別的多重RT—PCR等[6]。如Ishikawa[7]等根據(jù)S 基因序列設(shè)計了1對引物,成功地建立了診斷PEDV的RT—PCR方法。如Kubota 等[8]以M基因和N基因?yàn)榘谢蚪⒘薘T—PCR 方法來檢測PEDV。韓國人Kim O等[9]建立了TGEV和PEDV的二聯(lián)RT—PCR 診斷方法,可同時檢測出100 TCID50/mL的TGEV和PEDV。我國Zhao等[10]建立了可以同時鑒別PEDV、TGEV、PCV2和A型輪狀病毒的多重RT—PCR方法。但國內(nèi)外鮮有PEDV熒光定量RT—PCR檢測技術(shù)的報道。

      本研究以N基因?yàn)榘谢虺晒⒘薖EDV的TaqMan探針熒光定量RT—PCR 檢測技術(shù)及時填補(bǔ)了這一病毒檢測技術(shù)的空白,本方法可應(yīng)用于細(xì)胞毒和現(xiàn)地病料中PEDV的檢測,在病毒隱性感染、發(fā)病豬早期快速確診和實(shí)時檢測等方面發(fā)揮重要作用,為PEDV 感染、增殖規(guī)律的研究及病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程的研究奠定了重要基礎(chǔ)。與常規(guī)RT—PCR相比,本方法的靈敏度更高,假陽性率低,不易污染,且擴(kuò)增與檢測同步完成,不需要對產(chǎn)物進(jìn)行電泳,使得操作更加簡便。

      [1]Pensaert M B, de Bouck P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine [J].Arch Virology, 1978, 58(3): 243-247.

      [2]Park S J, Kim H K, Song D S, et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) fi eld isolates in Korea [J].Archives of virology, 2011, 156(4): 577-585.

      [3]Li Zhili, Zhu Ling, Ma Jingyun, et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) field strains in south China [J].Virus genes, 2012, 45(1): 181-185.

      [4]Zhang Qian, Hu Ruiming, Tang Xibiao, et al.Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China[J].Archives of virology, 2013, 158(8):1631-1636.

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      [8]Kubota S, Sasaki O, Amimoto K, et al.Detection of porcine epidemic diarrhea virus using polymerase chain reaction and comparison of the nucleocapsid protein genes among strains of the nucleocapsid genes among strains of the virus[J].Journal of Veterinary Medical Science, 1999, 61(7):827-830.

      [9]Kim O, Choi C, Kim B, et al.Detection and differentiation of porcine epidemic diarrhoea virus and transmissible gastroenteritis virus in clinical samples by multiplex RT—PCR[J].The Veterinary Record, 2000,146(22):637-640.

      [10]Zhao J, Shi B J, Huang X G, et al.A multiplex RT—PCR assay for rapid and differential diagnosis of four porcine diarrhea associated viruses in field samples from pig farms in East China from 2010 to 2012[J]. Journal of virological methods, 2013, 194(1/2):107-112.

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