吳 嵽，陸耀飛

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在骨骼肌的生長、維持和損傷后的修復(fù)過程中起著重要的作用［26］。對于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞而言，O2是一個非常重要的環(huán)境因素［9］。正常情況下，空氣中O2濃度約為21%，生理條件下，在體培養(yǎng)的骨骼肌纖維內(nèi)O2含量卻低于21%，約為5%［17］。有研究指出，＜6%的O2濃度可以認(rèn)為是低氧環(huán)境［12］；還有研究通過微電極測量發(fā)現(xiàn)：設(shè)定3%O2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)實際測得的濃度為3±2%，近似等于生理條件下的骨骼肌纖維中O2的水平［24］。又有研究認(rèn)為，從含標(biāo)準(zhǔn)濃度（5mM）至高濃度（20 to 115mM）葡萄糖的生長培養(yǎng)液來看，細(xì)胞的增殖與葡萄糖的濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系［20］。

本研究通過不同氧環(huán)境結(jié)合不同葡萄糖濃度，觀察兩者對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長的影響，探討可能的作用機(jī)制，為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、骨骼肌的損傷修復(fù)提供進(jìn)一步的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性SD大鼠2只，4周齡，體重120g，清潔級，由上海第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

原代培養(yǎng)后取第三代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為實驗對象。分組：對照組：生長培養(yǎng)液中不加細(xì)胞；實驗組：生長培養(yǎng)液中加細(xì)胞；實驗組又分為：常氧低糖組（21%O2＋5.5 mM Glu）、常氧高糖組（21%O2＋25mM Glu）、低氧低糖組（1%O2＋5.5mM Glu）、低氧高糖組（1%O2＋25mM Glu）。

1.2 主要儀器和試劑

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）、Leica倒置顯微鏡（Leica）、酶聯(lián)免疫檢測儀 （Bio－rad）、低氧工作站INVIVO2200（RUSKINN TECHNOLOGY）；DMEM、馬血清、胎牛血清（Gibco）、橫紋肌肌動蛋白抗體、SABC試劑盒、DAB顯色劑（武漢博士德）CCK－8試劑盒（南通碧云天）、LDH試劑盒（南京建成）。

1.3 實驗方法

1.3.1 準(zhǔn)備工作

手術(shù)前1天，0.001%的多聚賴氨酸工作液包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于超凈工作臺內(nèi)12h以上。包被完成后，吸去多余的多聚賴氨酸工作液，用0.01M無菌PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶底1～2次，置于超凈工作臺內(nèi)晾干備用。

1.3.2 原代培養(yǎng)

10%的水合氯醛以0.4ml／100g體重的劑量腹腔麻醉大鼠。無菌條件下分離兩側(cè)腓腸肌與比目魚肌，0.1%II型膠原酶消化后胎牛血清終止消化，棄去上清液，加入5 ml種植培養(yǎng)液后吹打混勻。收集細(xì)胞懸液，依次通過100目、200目、400目的不銹鋼細(xì)胞篩過濾后制成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。將細(xì)胞接種于未經(jīng)多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，種植密度不低于105個細(xì)胞／ml，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃，5%CO2，100%空氣濕度。2h后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液接種到新的未經(jīng)多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。2h后，將第一次差速貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液接種到經(jīng)多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，48h后首次換液。之后每隔兩天換液一次［1］。

1.3.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

胰蛋白酶消化細(xì)胞后，按1∶3比例將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中［1］。

1.3.4 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞純度鑒定

原代培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞傳代，繼續(xù)培養(yǎng)7d。棄去培養(yǎng)板中的生長培養(yǎng)液，用0.01MPBS清洗1次。4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min后，0.02MPBS清洗3次，3min／次。梯度酒精脫水：75%，85%，95%各1次，3min／次。3%H2O2室溫浸泡10min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，0.02M PBS清洗3次，3min／次。滴加5%BSA封閉液，37℃孵育20min，棄去多余液體，無需清洗。滴加1∶100稀釋的α－SCA，4℃過夜后，0.02MPBS清洗3次，3min／次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min，0.02MPBS清洗3次，3min／次。滴加試劑SABC，37℃孵育20min，0.02M PBS清洗3次，3min／次。使用DAB試劑盒，取1ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后加至培養(yǎng)板中，室溫顯色，倒置顯微鏡下觀察，控制反應(yīng)時間。10min后用蒸餾水終止反應(yīng)，然后用洗滌0.02MPBS清洗。顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞純度。細(xì)胞純度（%）＝（細(xì)胞總數(shù)－陰性細(xì)胞數(shù)）÷細(xì)胞總數(shù)×100%［6－7］。

1.3.5 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖測定

將傳代后的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞以2.5×104的密度接種在96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后更換相應(yīng)濃度葡萄糖的生長培養(yǎng)液。其中，常氧低糖實驗組的細(xì)胞加入低糖生長培養(yǎng)液中后在常氧環(huán)境中培養(yǎng)3h，常氧高糖實驗組加入高糖生長培養(yǎng)液后在常氧環(huán)境中培養(yǎng)3h；低氧低糖實驗組的細(xì)胞加入低糖生長培養(yǎng)液后在低氧環(huán)境中培養(yǎng)3h；低氧高糖實驗組的細(xì)胞加入高糖生長培養(yǎng)液后在低氧環(huán)境中培養(yǎng)3h后進(jìn)行增殖測定。每孔加入10μl CCK－8溶液。將加入相同量培養(yǎng)液和CCK－8溶液，但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1h。在450nm測定吸光度，記錄A值。

1.3.6 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞損傷測定

通過乳酸脫氫酶（LDH）法測定骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的損傷程度（表1）。

表1 本研究LDH法測定骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞損傷程度的實驗步驟一覽表Table 1 The Measurement of LDH Activity Released from Damaged Cells into the Supernatant

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài)

圖1 本研究原代培養(yǎng)后不同時相的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài)觀察圖（100×）Figure 1. Morphological Observations of Primary Cultured Skeletal Muscle Satellite Cells（100×）

2.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定

經(jīng)α－SCA actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)染成棕色（圖2）。

本實驗計數(shù)1 000個細(xì)胞。陰性細(xì)胞數(shù)為15。

細(xì)胞純度（%）＝（1000－15）÷ 1000×100%＝98.5%，達(dá)到了純化的目的（即細(xì)胞純度≥95%）。

圖2 本研究α－SCA actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色圖Figure 2. The Expression ofα－sarcomeric Actin（α－SCA）

2.3 不同氧氣濃度、不同葡萄糖濃度培養(yǎng)液對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖影響

表2 本研究不同氧氣濃度、不同葡萄糖濃度培養(yǎng)液對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響一覽表（A值，±SD）Table 2 The Effects of Oxygen and Glucose Concentration on the Proliferation of Satellite Cells（A value，±SD）

表2 本研究不同氧氣濃度、不同葡萄糖濃度培養(yǎng)液對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響一覽表（A值，±SD）Table 2 The Effects of Oxygen and Glucose Concentration on the Proliferation of Satellite Cells（A value，±SD）

常氧低糖 常氧高糖 低氧低糖 低氧高糖對照組0.119±0.006 0.131±0.003 0.120±0.007 0.139±0.012實驗組0.124±0.010 0.142±0.010 0.133±0.018 0.146±0.013

如圖3所示：放入培養(yǎng)箱中3h后，CCK－8的結(jié)果顯示，常氧低糖實驗組的A值高于對照組（P＜0.05），常氧高糖實驗組和低氧低糖實驗組的A值均顯著高于對照組（P＜0.01），低氧高糖實驗組與對照組之間的差異沒有顯著性（P＞0.05）。

圖3 本研究各對照組與實驗組之間骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖情況曲線圖Figure 3. The Proliferation of the Skeletal Muscle Satellite Cells of the Control Groups and the Experimental Groups

如圖4所示，放入培養(yǎng)箱3h后，CCK－8的結(jié)果顯示，常氧高糖實驗組的A值顯著高于常氧低糖實驗組（P＜0.01），低氧高糖實驗組的A值顯著高于低氧低糖實驗組（P＜0.01），表明相同氧氣濃度下，高葡萄糖濃度較低葡萄糖濃度的培養(yǎng)液更能促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖；低氧低糖實驗組的A值顯著高于常氧低糖實驗組（P＜0.01），表明相同葡萄糖濃度下，低氧濃度可以促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。

圖4 本研究實驗組之間骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖對比情況柱狀圖Figure 4. The Proliferation of the Skeletal Muscle Satellite Cells between the Experimental Groups

2.4 不同氧氣濃度、不同葡萄糖濃度培養(yǎng)液對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞釋放LDH的影響

表3 本研究不同氧氣濃度、不同葡萄糖濃度培養(yǎng)液對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞釋放LDH的影響一覽表（A值，±SD）Table 3 The Effects of Oxygen and Glucose Concentration on the LDH Activity Released from the Damaged Satellite Cells（A value，±SD）

表3 本研究不同氧氣濃度、不同葡萄糖濃度培養(yǎng)液對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞釋放LDH的影響一覽表（A值，±SD）Table 3 The Effects of Oxygen and Glucose Concentration on the LDH Activity Released from the Damaged Satellite Cells（A value，±SD）

常氧低糖 常氧高糖 低氧低糖 低氧高糖對照組0.907±0.013 0.918±0.036 1.080±0.053 1.062±0.069實驗組0.964±0.043 0.980±0.051 1.115±0.124 1.139±0.053

如圖5所示，放入培養(yǎng)箱3h后，LDH的結(jié)果顯示，常氧低糖實驗組、常氧高糖實驗組和低氧高糖實驗組的A值均顯著高于對照組（P＜0.01），低氧低糖實驗組和對照組之間的差異沒有顯著性（P＞0.05）。

圖5 本研究各對照組與實驗組之間骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞釋放LDH的情況曲線圖Figure5.The LDH Activity Released from Damaged Skeletal Muscle Satellite Cells of the Control Groups and the Experimental Groups

如圖6所示，培養(yǎng)3h后，LDH的結(jié)果顯示，低氧低糖實驗組的A值顯著高于常氧低糖實驗組（P＜0.01），低氧高糖實驗組的A值顯著高于常氧高糖實驗組（P＜0.01），表明相同葡萄糖濃度下，低氧會使骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的LDH釋放量增加。

圖6 本研究實驗組之間骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞釋放LDH的情況柱狀圖Figure 6. The LDH Activity Released from Damaged Skeletal Muscle Satellite Cells between the Experimental Groups

3 分析與討論

3.1 不同葡萄糖濃度對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖程度的影響

生物在物質(zhì)代謝和能量代謝的基礎(chǔ)上完成各種基本生命活動。葡萄糖作為骨骼肌收縮的重要能源物質(zhì)之一，主要通過以下代謝途徑參與機(jī)體的物質(zhì)合成與能量供應(yīng)：糖酵解、磷酸戊糖途徑、蘋果酸－天冬氨酸穿梭、甘油磷酸穿梭、三羧酸循環(huán)、呼吸鏈。細(xì)胞的糖代謝取決于細(xì)胞對葡萄糖的攝取，由于葡萄糖無法自由通過細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞，因此，細(xì)胞對葡萄糖的攝入需要借助細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glucose transporter，GLUT）來完成［33］。本實驗中，在相同氧濃度下，使用含不同濃度葡萄糖的生長培養(yǎng)液培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞3h后，CCK－8測定顯示，常氧低糖實驗組的A值高于對照組（P＜0.05），常氧高糖實驗組和低氧低糖實驗組的A值均顯著高于對照組（P＜0.01，圖3）；常氧高糖實驗組的A值顯著高于常氧低糖實驗組（P＜0.01），低氧高糖實驗組的A值顯著高于低氧低糖實驗組（P＜0.01，圖4），表明相同氧氣濃度下，高葡萄糖濃度較低葡萄糖濃度的培養(yǎng)液更能促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖?？赡艿臋C(jī)制是，高葡萄糖濃度培養(yǎng)液中較多的葡萄糖分子與GLUT結(jié)合后進(jìn)入骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞膜內(nèi)，從而引起合成增加。有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖可以增加細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B（Akt）的表達(dá)，以及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）的磷酸化，同時，也會增加cyclin D1、cyclin E、CDK 2和CDK 4的水平，這些因子可以共同作用，促使骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞從G1期轉(zhuǎn)入S期，進(jìn)一步合成DNA，進(jìn)行細(xì)胞分裂和增殖［15］。因此可以推斷，葡萄糖主要是通過PI3－K／Akt和 MAPKs作用于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞使其增殖的。適當(dāng)提高培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度將有利于細(xì)胞的增殖。但是，葡萄糖的濃度是否應(yīng)該保持在既能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，又不至于過高而影響細(xì)胞正常代謝值，需要后續(xù)實驗來檢測骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞對葡萄糖濃度的依賴性。

3.2 不同氧氣濃度對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖程度的影響

有研究表明，O2的相關(guān)信號通路對衛(wèi)星細(xì)胞起著重要的作用，可能影響到細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控，從而影響骨骼肌的生長［8］。

本實驗參照先前的研究［23］，選取的低氧環(huán)境為1%O2。本實驗發(fā)現(xiàn)，低氧低糖實驗組的A值顯著高于常氧低糖實驗組（P＜0.01，圖4），證明了在低氧條件下，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖程度會增加。而在最近的研究中在2%和20%的氧環(huán)境下，觀察了 Myod、Myf5和CD34的表達(dá)，低氧環(huán)境下的表達(dá)均高于常氧環(huán)境下的表達(dá)，也應(yīng)證了本實驗的結(jié)果［32］。一方面，細(xì)胞在低氧環(huán)境下會抑制氧化磷酸化水平，ATP的生成主要依賴加快糖酵解速度來實現(xiàn)。細(xì)胞會上調(diào)與糖酵解有關(guān)酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來適應(yīng)這種轉(zhuǎn)變。主要是抑制細(xì)胞內(nèi)脯氨酸殘基的羥化酶作用，后者使脯氨酸殘基羥化，產(chǎn)生低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia Inducible Factor，HIF），使細(xì)胞對低氧環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)，降低細(xì)胞的氧消耗，且HIF可以調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取，增加蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞的增殖［27］。具體 HIF促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖的調(diào)節(jié)途徑需要后續(xù)研究來證明。另一方面，Notch信號傳尋途徑在對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化起著重要的作用［14］，同時，還受到環(huán)境氧分壓（ambient oxygen tension）的調(diào)節(jié)［2，5］——主要體現(xiàn)在：低氧通過激活Notch信號傳導(dǎo)途徑，上調(diào)表達(dá)Pax7，同時下調(diào)miR－1和miR－206的表達(dá)，加快骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的自我更新速率。在此基礎(chǔ)上可以認(rèn)為，在骨骼肌損傷或者衰老之后，能夠通過加強(qiáng)低氧暴露來促進(jìn)骨骼肌的再生和修復(fù)。在Gustafsson等人的研究中發(fā)現(xiàn)，低氧會通過激活Notch或者Pax7信號通路來使成肌細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)［14］。雖然說抑制細(xì)胞分化未必一定促進(jìn)細(xì)胞增殖，但是基于Pax7的表達(dá)上調(diào)和Myod以及肌細(xì)胞生成素的表達(dá)下調(diào)來看［18－19］，低氧確實可以使骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在分化抑制狀態(tài)下進(jìn)一步增殖。由此得出，低氧環(huán)境可以調(diào)節(jié)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息與分化狀態(tài)的平衡，促進(jìn)細(xì)胞的不對稱分裂。研究表明，葡萄糖濃度可能是一個調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原的重要因素［28－29］。能夠有效地通過磷酸戊糖途徑 （pentose phosphate pathway，PPP）來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長［3］，而 PPP在低氧環(huán)境下比常氧環(huán)境下更容易被激活［13］。也有可能低氧會使生肌調(diào)節(jié)因子MyoD和MRF上調(diào)，從而促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖［8］。還有研究認(rèn)為，G1／S期細(xì)胞通過磷酸化可以激活A(yù)kt信號，是各種不同類型的細(xì)胞在低氧條件下的適應(yīng)和生存的機(jī)制之一［4］，由此可以推測，該結(jié)論也同樣適用于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期常阻滯于 G1／S，尤其是 G1末期的限制性調(diào)控點(diǎn)“R”點(diǎn)［11，30］，而降低氧濃度（1%）相對于常氧環(huán)境而言，可以通過升高細(xì)胞周期 G1／S轉(zhuǎn)換調(diào)控因子——cyclin D1、cyclin E、cyclin A、CDK 2的水平來促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時降低細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27Kip1的水平［22］。這也能夠解釋在低氧和高糖的共同作用下，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖程度最為明顯（表3）。

3.3 不同氧氣濃度對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞釋放LDH的影響

本實驗在常氧和低氧環(huán)境中培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞3h后，進(jìn)行乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測實驗［25］。

LDH是質(zhì)膜完整性的常用標(biāo)志物。試劑中的NAD＋被 LDH 還原生成 NADH，NADH 和INT（2－p－iodophenyl－3－nitrophenyl tetrazolium chloride）被硫辛酰胺脫氫酶（diaphorase）催化反應(yīng)生成 NAD＋和強(qiáng)生色物甲臜（formazan），在490nm波長下產(chǎn)生吸收峰，從而可以通過比色來定量LDH的活性。A值與LDH活性成線性正相關(guān)。在低氧環(huán)境中培養(yǎng)3h后，LDH的測定結(jié)果顯示，低氧低糖實驗組的A值顯著高于常氧低糖實驗組（P＜0.01），低氧高糖實驗組的A值顯著高于常氧高糖實驗組（P＜0.01），綜合圖4和圖6的結(jié)果可以看出，可以認(rèn)為，在相同葡萄糖濃度下，盡管低氧能夠促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，但也會使骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的LDH釋放量增加。有研究表明，低氧環(huán)境會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP含量減少，當(dāng)從低氧環(huán)境下轉(zhuǎn)換到常氧環(huán)境之后，可以使降低的ATP水平恢復(fù)正常。然而，當(dāng)細(xì)胞在低氧環(huán)境中暴露時間超過8h后，可能會導(dǎo)致ATP含量的不可逆減少，甚至引起細(xì)胞死亡［31］。LDH被釋放的原因可能是在低氧環(huán)境的刺激下，細(xì)胞中的可用營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快，如葡萄糖等，細(xì)胞膜受到輕微刺激，但并未引起形態(tài)學(xué)上的細(xì)胞膜損傷時，可能導(dǎo)致LDH被釋放到細(xì)胞膜外，當(dāng)ATP被耗盡后，細(xì)胞膜的完整性被破壞［10，16］，其中，細(xì)胞膜的損傷程度決定了 LDH 的釋放量。在低氧條件下，由于糖酵解造成糖原減少，乳酸和無機(jī)磷在細(xì)胞內(nèi)堆積。脂肪氧化不全使其中間代謝產(chǎn)物酮體增多，將引起細(xì)胞pH值下降。有研究表明，初始pH值為7.4的細(xì)胞在常氧環(huán)境（21%）和低氧環(huán)境（0.1%）分別培養(yǎng)1h后發(fā)現(xiàn)，pH值下降為7.08［21］。pH降低可引起磷脂酶活性增高，使溶酶體膜磷脂被分解，同時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷以及蛋白質(zhì)的合成障礙將進(jìn)一步導(dǎo)致溶酶體膜損傷，細(xì)胞膜通透性增高，可能導(dǎo)致LDH的溢出釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞損傷嚴(yán)重時，甚至可能引起溶酶體腫脹、破裂，溶酶體酶釋出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)其他結(jié)構(gòu)的損傷加重，細(xì)胞內(nèi)含物釋放至細(xì)胞外，將引起周圍組織的炎癥反應(yīng)，甚至細(xì)胞壞死。由此看來，本實驗將骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞暴露在低氧中培養(yǎng)3h雖然引起了LDH的釋放，但并未達(dá)到引起細(xì)胞膜損傷的刺激閾值，沒有破壞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞膜的完整性。

4 結(jié)論

相同氧氣濃度下，高葡萄糖濃度較低葡萄糖濃度的培養(yǎng)液更能促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。相同葡萄糖濃度下，低氧濃度可以促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。在兩者共同干預(yù)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長時發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖濃度、低氧濃度可促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，低氧濃度將引起骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的輕微損傷（或細(xì)胞膜通透性增加）。

限于本研究的條件所限，一些問題難以避免，在實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，需要進(jìn)行更多的后續(xù)實驗來進(jìn)行完善和證明，包括：1）骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞對葡萄糖濃度的依賴性是否存在線性關(guān)系，是否一味升高濃度均能促進(jìn)其生長，抑或是存在一個較合適的促進(jìn)增殖的濃度，并能夠聯(lián)系到在體情況下，例如糖尿病患者在發(fā)生骨骼肌損傷之后的修復(fù)過程的探討及研究；2）葡萄糖引起骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑只是通過一些研究的總結(jié)和分析之后進(jìn)行了推導(dǎo)，未來研究需要進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)；3）在氧氣濃度降低到影響骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的正常生長之后，如何促進(jìn)其恢復(fù)。

［1］吳嵽，陸耀飛.機(jī)械生長因子對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活的影響及與其增殖的量效關(guān)系［J］.體育科學(xué)，2011，31（2）：54－69.

［2］ACHARYYA S，SHARMA S M，CHENG A S，et al.TNF inhibits Notch－1in skeletal muscle cells by Ezh2and DNA methylation mediated repression：implications in duchenne muscular dystrophy［J］.PLoS One，2010，5（8）：e12479.

［3］ALMEIDA A，DELGADO－ESTEBAN M，BOLA?OS J P，et al.Oxygen and glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurones but not in astrocytes in primary culture［J］.J Neurochemistry，2002，81（2）：207－217.

［4］BEITNER－JOHNSON D，RUST R T，HSIEH T C，et al.Hypoxia activates Akt and induces phosphorylation of GSK－3in PC12cells［J］.Cellular Signalling，2001，13（1）：23－27.

［5］BRACK A S，CONBOY I M，CONBOY M J，et al.A temporal switch from notch to Wnt signaling in muscle stem cells is necessary for normal adult myogenesis［J］.Cell Stem Cell，2008，2（1）：50－59.

［6］CHAKRAVARTHY M V，DAVIS B S，BOOTH F W.IGF－I restores satellite cell proliferative potential in immobilized old skeletal muscle［J］.J Appl Physi，2000，89（4）：1365－1379.

［7］CHAKRAVARTHY M V，SPANGENBURG E E，BOOTH F W.Culture in low levels of oxygen enhances in vitro proliferation potential of satellite cells from old skeletal muscles［J］.Cellular Molecular Life Sci CMLS，2001，58（8）：1150－1158.

［8］CSETE M，WALIKONIS J，SLAWNY N，et al.Oxygen－mediated regulation of skeletal muscle satellite cell proliferation and adipogenesis in culture［J］.J Cellular Physiol，2001，189（2）：189－196.

［9］CSETE M.Oxygen in the cultivation of stem cells［J］.Ann New York Academy Sci，2005，1049（1）：1－8.

［10］DRENT M，COBBEN N A，HENDERSON R F，et al.Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation［J］.Eur Respirat J，1996，9（8）：1736－1742.

［11］DULIC V，DRULLINGER L F，LEES E，et al.Altered regulation of G1cyclins in senescent human diploid fibroblasts：accumulation of inactive cyclin E－Cdk2and cyclin D1－Cdk2complexes［J］.Proceed National Academy Sci，1993，90（23）：11034－11038.

［12］GAWLITTA D，LI W，OOMENS C W，et al.The relative contributions of compression and hypoxia to development of muscle tissue damage：an in vitro study［J］.Ann Biomed Engineer，2007，35（2）：273－284.

［13］GUPTE S A，OKADA T，MCMURTRY I F，et al.Role of pentose phosphate pathway－derived NADPH in hypoxic pulmonary vasoconstriction［J］.Pulmonary Pharmacol Therapeutics，2006，19（4）：303－309.

［14］GUSTAFSSON M V，ZHENG X，PEREIRA T，et al.Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state［J］.Developmental Cell，2005，9（5）：617－628.

［15］KIM Y H，HEO J S，HAN H J.High glucose increase cell cycle regulatory proteins level of mouse embryonic stem cells via PI3－K／Akt and MAPKs signal pathways［J］.J Cellular Physiol，2006，209（1）：94－102.

［16］LEIST M，SINGLE B，CASTOLDI A F，et al.Intracellular adenosine triphosphate（ATP）concentration：a switch in the decision between apoptosis and necrosis［J］.J Exp Med，1997，185（8）：1481－1486.

［17］LI T S，MARBáN E.Physiological levels of reactive oxygen species are required to maintain genomic stability in stem cells［J］.Stem Cells，2010，28（7）：1178－1185.

［18］LIU W，WEN Y，BI P，et al.Hypoxia promotes satellite cell self－renewal and enhances the efficiency of myoblast transplantation［J］.Development，2012，139（16）：2857－2865.

［19］MAJMUNDAR A J，SKULI N，MESQUITA R C，et al.O2Regulates Skeletal Muscle Progenitor Differentiation through Phosphatidylinositol 3－Kinase／AKT Signaling［J］.Molecular Cellular Biology，2012，32（1）：36－49.

［20］STANLEY NAHMAN JR N，LEONHART K L，COSIO F G，et al.Effects of high glucose on cellular proliferation and fibronectin production by cultured human mesangial cells［J］.Kidney Int，1992，41（2）：396－402.

［21］PARKS S K，MAZURE N M，COUNILLON L，et al.Hypoxia promotes tumor cell survival in acidic conditions by preserving ATP levels［J］.J Cellular Physiol，2013，228（9）：1854－1862.

［22］POLYAK K，LEE M H，ERDJUMENT－BROMAGE H，et al.Cloning of p27Kip1，a cyclin－dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals［J］.Cell，1994，78：59－66.

［23］RHOADS R P，JOHNSON R M，RATHBONE C R，et al.Satellite cell－mediated angiogenesis in vitro coincides with a functional hypoxia－inducible factor pathway［J］.Am J Physiology－Cell Physiol，2009，296（6）：C1321－C1328.

［24］RICHARDSON R S，NOYSZEWSKI E A，LEIGH J S，et al.Lactate efflux from exercising human skeletal muscle：role of intracellular［J］.J Appl Physiol，1998，85（2）：627－634.

［25］ROTH W，F(xiàn)ONTANA A，TREPEL M，et al.Immunochemotherapy of malignant glioma：synergistic activity of CD95ligand and chemotherapeutics［J］.Cancer Immunol，Immunotherapy，1997，44（1）：55－63.

［26］SEALE P，RUDNICKI M A.A new look at the origin，function，and“stem－cell”status of muscle satellite cells［J］.Developmental Biol，2000，218（2）：115－124.

［27］SEMENZA G L.HIF－1：mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia［J］.J Appl Physiol，2000，88（4）：1474－1480.

［28］SEO S Y，KIM E Y，KIM H，et al.Attenuation of neuronal death by NMDA and oxygen－glucose deprivation in cortical neurons maintained in high glucose［J］.Ann New York Academy Sci，1999，893（1）：396－399.

［29］SEO S Y，KIM E Y，KIM H，et al.Neuroprotective effect of high glucose against NMDA，free radical，and oxygen－glucose deprivation through enhanced mitochondrial potentials［J］.J Neurosci，1999，19（20）：8849－8855.

［30］SMITH J R，PEREIRA－SMITH O M.Replicative senescence：implications for in vivo aging and tumor suppression［J］.Sci，1996，273（5271）：63－67.

［31］STEINBACH J P，WOLBURG H，KLUMPP A，et al.Hypoxiainduced cell death in human malignant glioma cells：energy deprivation promotes decoupling of mitochondrial cytochrome c release from caspase processing and necrotic cell death［J］.Cell Death Differentiat，2003，10（7）：823－832.

［32］URBANI L，PICCOLI M，F(xiàn)RANZIN C，et al.Hypoxia increases mouse satellite cell clone proliferation maintaining both in vitro and in vivo heterogeneity and myogenic potential［J］.PloS one，2012，7（11）：e49860.

［33］VANDER HEIDEN M G，PLAS D R，RATHMELL J C，et al.Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism［J］.Molecular Cellular Biol，2001，21（17）：5899－5912.