龔麗景，胡 揚，李燕春，梅 濤

目前，對于與運動能力相關(guān)分子標(biāo)記的研究多采用關(guān)聯(lián)分析法，但是，通過此法無法闡明分子標(biāo)記對運動能力的影響機(jī)制，同時存在關(guān)聯(lián)分析結(jié)果假陽性的現(xiàn)象。因此，通過本研究對已發(fā)現(xiàn)的與運動能力相關(guān)位點進(jìn)行基因功能學(xué)研究，在基因表達(dá)層次上對以統(tǒng)計學(xué)研究基礎(chǔ)上的結(jié)果進(jìn)一步深入研究，闡明分子標(biāo)記對有氧耐力影響的分子機(jī)制。

本研究命題旨在將課題組10年來發(fā)現(xiàn)的所有分子標(biāo)記進(jìn)行功能學(xué)研究，從而進(jìn)一步定位與運動能力相關(guān)的分子標(biāo)記。

1 前言

線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是真核生物核基因組之外的遺傳物質(zhì)，編碼著大約22個轉(zhuǎn)移RNA（tRNAs），大小2個核糖體 RNA（rRNA）和哺乳動物線粒體呼吸鏈中的13種疏水性蛋白質(zhì)多肽［3］，在能量轉(zhuǎn)換、細(xì)胞代謝等生理過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。因動物體內(nèi)85%的能量產(chǎn)生于線粒體，線粒體的生物合成對與耐力和力量運動相關(guān)的成績有著密切聯(lián)系，并且mtDNA類型對耐力型運動員比力量型運動員的運動能力影響更大［8－9］。同時，人類線粒體的基因排列非常緊湊，任何微小的突變都有可能導(dǎo)致其功能區(qū)域的變化并有可能導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變［4，6，15，18，20］。MtDNA的非編碼區(qū)包含 D－Loop區(qū)，它的功能在于調(diào)控mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制［15］。對110名優(yōu)秀長跑運動員和170名普通對照組的mtDNA全基因組解析表明，發(fā)現(xiàn) D－Loop區(qū) mt235、mt514－515、mt16183、mt16290和mt16319多態(tài)位點在運動員組和普通對照組分布頻率有極顯著差異（P＜0.01）。但這些差異是否影響下游基因的表達(dá)，至今未見報道。因此，本研究擬通過雙熒光素酶報告基因檢測方法，觀察上述位點多態(tài)性對下游基因表達(dá)的影響，以探討有氧運動能力的分子調(diào)控機(jī)理。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

載體 pGL3－basic、pGL3－promoter、pRL－TK、pRL－SV40、PureYieldTMPlasmid Midiprep System、FuGENE○R6Transfection Reagent、Dual－Luciferase○RReporter Assay System 均為Promega公司產(chǎn)品，F(xiàn)etal bovine serum（FBS）、高糖 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶／EDTA 消化液為Gibco公司產(chǎn)品，PBS（pH 7.4）、氨芐青霉素為Sigma公司產(chǎn)品。RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞／細(xì)菌總RNA提取試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組）和SuperReal熒光定量預(yù)混試劑（SYBR Green）均購自TIANGEN公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。293T細(xì)胞為北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所惠贈。

低溫高速離心機(jī)（Beckman），常溫離心機(jī)（白洋），Glo Max 20／20化學(xué)發(fā)光儀 （Promega），二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo），倒置顯微鏡IX70（Olympus），超凈工作臺（上海博訊），實時熒光定量PCR儀（ABI 7500），NanoDrop超微量分光光度計（Thermo）等。

2.2 實驗方法

2.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)SNPs序列信息，在線粒體基因劍橋序列找到mtDNA的D－Loop區(qū)序列［12］，采用全基因組合成方法合成含 mt235、mt514－515、mt16183、mt16290和 mt16319位點的基因片段，片段序列見表1。由上海捷瑞生物工程有限公司合成所需的5對目的片段，并連接至pGL3－Promoter載體。

將所得質(zhì)粒甘油菌擴(kuò)大搖菌16h后，用Promega無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒提取質(zhì)粒，再用NanoDrop分光光度計測定各質(zhì)粒在260、280和230nm波長下的吸光度值，以計算其濃度、A260／A280和A260／A230的比值。

2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞使用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天293T細(xì)胞長滿至培養(yǎng)瓶底的80%，用胰酶消化分離成單細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞，再用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至細(xì)胞密度為3×105個／ml，向24孔板中加入0.5ml／孔細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24h后細(xì)胞生長至60%～70%，配制轉(zhuǎn)染混合物，Promega FuGENE○R6轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA的按照3：1的比例混合［13］，步驟按說明書進(jìn)行。24孔板加入25μl／孔轉(zhuǎn)染混合物，搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)24h。因研究時間不同，mt235、mt514－515和mt16183位點質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時采用海腎熒光素酶質(zhì)粒pRLSV40為共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（構(gòu)建質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒＝10∶1），mt16290和mt16319位點質(zhì)粒采用pRL－TK為共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（構(gòu)建質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒＝20：1）。質(zhì)粒pGL3－basic為對照組，質(zhì)粒pGL3－promoter為陽性對照組，所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染均做3孔平行。

2.2.3 熒光素酶相對活性檢測

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶活性使用Promega公司的Dual－Luciferase○RReporter Assay System 試劑盒，在 Glo Max 20／20化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行螢火蟲熒光素酶活性（F值）和海腎熒光素酶活性（R值）的檢測。每個孔檢測3次。

2.2.4 熒光素酶mRNA的表達(dá)

采用實時熒光定量PCR檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)熒光素mRNA的表達(dá)。在GenBank數(shù)據(jù)庫查找pGL3－Promoter基因序列（U47298.2），基因總長5010bp，其中CDS區(qū)在280～1932bp之間。內(nèi)參基因選用GAPDH基因（NCBI RefSeq：NC＿000012.11），全長3953bp。使用Primer Premier 5設(shè)計熒光素酶的引物（在CDS區(qū)），GAPDH引物參考RTPrimerDB數(shù)據(jù)庫［14］，具體見表2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 本研究目的基因的合成片段序列一覽表Table 1 The Synthesized Sequences of Target Gene

表2 本研究熒光素酶基因和內(nèi)參基因引物一覽表Table 2 The Primers of the Luciferase Gene and GAPDH Gene

所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24h，pRL－TK為共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（構(gòu)建質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒＝20∶1）。使用RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，測定OD230、OD260和 OD280，計算濃度和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳查看純度，使用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑（含SYBR Green I）做實時熒光qPCR，模板為1μl cDNA于20μl反應(yīng)體系中，操作按照說明書完成。兩步法反應(yīng)程序是：95℃預(yù)變性15min；95℃10s→60℃32s，共40個循環(huán)；最后自動添加融解曲線，條件為95℃15s→60℃1min→95℃15s。

2.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

熒光素酶報告基因檢測結(jié)果以螢火蟲熒光素酶發(fā)光值／海腎熒光素酶發(fā)光值為表達(dá)活性（F／R），數(shù)據(jù)均以±SD表示，各組間比較采用單因素方差（ANOVA）分析；實時熒光定量PCR結(jié)果以2－ΔΔct來表示，以±SD表示，組間比較采用t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶報告基因相對活性結(jié)果

經(jīng)過檢測，所提取的質(zhì)粒濃度為378.69±51.95ng／μl，OD260／280為1.92±0.005，大于1.8，說明樣本不含酚或者蛋白質(zhì)；OD260／230為2.11±0.02，大于2.0，說明樣本沒有殘存鹽或者小分子雜質(zhì)污染，所提取的質(zhì)粒純度高，可以用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后檢測熒光素酶活性，計算F／R活性比值。單因素方差分析F／R結(jié)果如圖1顯示。與各自pGL3－basic相比，pGL3－mt235A、 pGL3－514－515CA、 pGL3－mt16183A、 pGL3－mt16290C、pGL3－mt16290T、pGL3－mt16319G 和 pGL3－mt16319A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶活性都極顯著升高（P＜0.01）。相反，pGL3－mt235G、pGL3－514－515Del和pGL3－mt16183C質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后F／R比pGL3－basic有極顯著降低（P＜0.01）。與各自pGL3－Promoter質(zhì)粒相比，pGL3－514－515CA、pGL3－mt16183A、pGL3－mt16290C 和 pGL3－mt16290T極顯著升高 （P＜0.01），但 pGL3－mt235A、pGL3－mt16319G 和 pGL3－mt16319A 的 F／R 值比 pGL3－Promoter質(zhì)粒下降。

用獨立樣本t檢驗分析攜帶同位點不同基因型的質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)pGL3－mt235A、pGL3－514－515CA、pGL3－mt16183A和pGL3－mt16319G轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶相對活性顯著高于 pGL3－mt235G、pGL3－514－515Del、pGL3－mt16183C 和pGL3－mt16319A（P＜0.01）。但pGL3－mt16290C和 T質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性之間沒有差別。

3.2 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶mRNA表達(dá)結(jié)果

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞總RNA的濃度為71.91±6.14 μg／ml，OD260／280為2.09±0.01，OD260／230為2.2±0.06，說明純度和濃度都較高，可以用于后續(xù)研究。采用相對定量PCR法，檢測各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的目的基因和內(nèi)參基因Ct值，進(jìn)而計算2－ΔΔct來顯示熒光素酶mRNA表達(dá)結(jié)果，如表3及圖2所示。單因素方差分析結(jié)果，pGL3－mt235A、pGL3－mt235C、pGL3－514－515CA、pGL3－514－515Del、pGL3－mt16183A 和 pGL3－mt16319G 轉(zhuǎn)染 后細(xì)胞的熒光素酶mRNA表達(dá)比pGL3－basic的有極顯著升高（P＜0.01），pGL3－mt16290C 和 pGL3－mt16319G 升高顯著（P＜0.05）。而 pGL3－Promoter、pGL3－mt16183C 和pGL3－mt16290T較pGL3－basic轉(zhuǎn)染后的熒光素酶 mRNA高卻沒有顯著差別，但pGL3－mt16319A極顯著降低（P＜0.01）。 與 pGL3－Promoter 質(zhì)粒相比，pGL3－mt235A、pGL3－mt235C、 pGL3－514－515CA、 pGL3－514－515Del、pGL3－mt16183A有極顯著升高（P＜0.01）。

用獨立樣本t檢驗分析發(fā)現(xiàn)，pGL3－mt235A、pGL3－mt16183A 和 pGL3－mt16319G 較 pGL3－mt235G、pGL3－mt16183C和pGL3－mt16319A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光素酶mRNA顯著性高（P＜0.01），pGL3－514－515CA 比 pGL3－514－515Del的也有顯著性提高（P＜0.05）。但是，pGL3－mt16290C和pGL3－mt16290T質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光素酶mRNA之間沒有差別。

圖1 本研究不同基因型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24h后的相對熒光素酶活性F／R的比較柱狀圖Figure 1. The Relative Luciferase Activity F／R in Cell Transfected by Different Genotypes after 24h

表3 本研究各基因型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶mRNA相對表達(dá)量比較一覽表Table 3 The Luciferase mRNA Expression in Cells Transfected by Different Genotypes Plasmids

4 討論

4.1 mtDNA非編碼區(qū)位點變異對熒光素酶相對活性的影響

mtDNA的控制區(qū)（Control Region，包括 Displacement Loop，簡稱D－Loop區(qū)），包括 H鏈的啟動子（HSP）、L鏈啟動子（LSP）、H鏈復(fù)制子 Oh、保守序列節(jié)段（Conserved sequence block，CSB）及L鏈上的終止結(jié)合序列（TAS）。線粒體mRNA從單一位點轉(zhuǎn)錄，即所有tRNA，rRNA，mRNA均由同一順反子轉(zhuǎn)錄而來［11］。mtDNA的轉(zhuǎn)錄從HSP和LSP兩處開始，轉(zhuǎn)錄因子（mtTF1）與LSP、HSP起點特異性結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄酶，轉(zhuǎn)錄開始后產(chǎn)生一個多順反子，其中包括mRNA和散在分布其中的tRNA，剪切位點多在tRNA處，從而分離釋放出 mRNA、tRNA［21］。D－Loop區(qū)是 mtDNA的非編碼區(qū)之一，它的功能在于調(diào)控mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。本研究中的5個位點位于D－Loop區(qū)內(nèi)不同的功能區(qū)。mt235位于mtDNA的CSB1區(qū)［7］和mtTF1binding site（TFX）［10］，是這兩個區(qū)共有的位點。 研究結(jié)果顯示，pGL3－235A的F／R極顯著高于pGL3－235G的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果，說明mt235A的對下游基因的表達(dá)作用強(qiáng)于mt235G。mt514－515位點位于D－Loop區(qū)的高變區(qū)3（Hypervariable segment3，HV3），兩個位點完全連鎖（r＝1.0）。研究結(jié)果顯示，pGL3－514－515CA 的 F／R 極顯著高于pGL3－514－515Del的，說明 mt514－515CA對基因表達(dá)的作用強(qiáng)于 mt514－515Del 的作用。mt16183、mt16290、mt16319位點均位于D－Loop區(qū)的7SDNA上［2］。從報告基因的 F／R值看，pGL3－16183A 和 pGL3－16319G分別極顯著高于pGL3－16183C和pGL3－16319A，說明 mt16183A和mt16319G具有上調(diào)基因表達(dá)的作用。而pGL3－16290C和pGL3－16290T的F／R沒有差別，推測該位點變異可能對基因表達(dá)沒有影響。

圖2 本研究各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶mRNA相對表達(dá)量比較柱狀圖Figure2.The Luciferase mRNA Expression in Cells Transfected by Different Genotypes Plasmid

4.2 mtDNA非編碼區(qū)位點變異對報告基因mRNA表達(dá)的影響

近年來，通過基因多態(tài)性與長壽、疾病、運動能力等的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)［1，5，19］，線粒體基因突變與生命現(xiàn)象有緊密關(guān)聯(lián)。比如，mtDNA的突變和減少被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的因素。通過結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HCT－8的mtDNA和ATP含量顯著下降，同時伴隨mtDNA編碼的mRNAs減少的研究，細(xì)胞對抗癌藥的敏感性下降和蓄積，產(chǎn)生HCT－8細(xì)胞的多重耐藥性（MDR）表型，同時發(fā)現(xiàn)mtDNA減少的細(xì)胞的MDR1mRNA及其翻譯產(chǎn)物P糖蛋白的上升是由于RNA穩(wěn)定性增加，而不是轉(zhuǎn)錄激活［16］。通過構(gòu)建結(jié)腸直腸癌細(xì)胞SW480線粒體D－loop區(qū)的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NIH3T3／SW480細(xì)胞的生長率和集群率顯著升高，細(xì)胞凋亡率下降，同時在NIH3T3／SW480細(xì)胞發(fā)現(xiàn)多倍的和畸形的染色體，說明結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的mtDNA會提高NIH3T3細(xì)胞的惡性表型，并建議對NIH3T3／SW480細(xì)胞的生物功能做研究，進(jìn)一步解釋mtDNA在結(jié)腸直腸癌中的作用［17］。

線粒體基因調(diào)控和編碼的基因（如ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6，COX1和 COX2，ATP6、ATP8等）對有氧運動有著極為密切的聯(lián)系，但是，mtDNA位點突變對運動能力的關(guān)聯(lián)研究不多，進(jìn)一步對生物功能的研究更少。在前期研究mtDNA多態(tài)性與有氧運動能力的關(guān)聯(lián)分析獲得5個陽性位點，研究這些位點的生物功能的同時，為了檢驗mtDNA對報告基因的轉(zhuǎn)錄水平影響，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶mRNA水平檢測。對每個位點進(jìn)行獨立樣本t檢驗分析，發(fā)現(xiàn)pGL3－235A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中報告基因mRNA表達(dá)極顯著高于pGL3－235G的，pGL3－16183A的極顯著高于 pGL3－16183C，同樣 pGL3－16319G的 mRNA表達(dá)極顯著高于pGL3－16319A，P＜0.01，與報告基因相對活性 F／R結(jié)果一致。pGL3－514－515CA顯著高于 pGL3－514－515Del（P＜0.05），基本與F／R結(jié)果（P＜0.01）相符合。報告基因的相對活性和mRNA 表達(dá)結(jié)果一致，表明 mt235A、mt514－515CA、mt16183A和mt16319G對下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯均有上調(diào)作用，而 mt235G、mt514－515Del、mt16183C 對下游基因表達(dá)低于 mt235A、mt514－515CA、mt16183A 的調(diào)節(jié)作用，mt16319A甚至下調(diào)下游基因的表達(dá)。pGL3－16290C與pGL3－16290T之間沒有顯著性差異，這與報告基因相對活性F／R的結(jié)果一致，說明mt16290位點變異對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯沒有差別影響。

5 小結(jié)

根據(jù)優(yōu)秀運動員和普通人對比篩選出來的5個mtDNA陽性多態(tài)位點，本研究通過生物功能研究，發(fā)現(xiàn)mt235A、mt514－515CA、mt16183A和 mt16319G可以上調(diào)報告基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，推斷可能對耐力運動員的運動能力表型產(chǎn)生影響；而mt16290位點變異對基因表達(dá)沒有區(qū)別影響。

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