鄧展?jié)?章文文 易龍

（江蘇省南京市南京大學(xué)醫(yī)學(xué)分子技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210093）

FOG2基因在圓錐動脈干發(fā)育畸形患者中的外顯子突變和拷貝數(shù)量變化的研究

鄧展?jié)?章文文 易龍*

（江蘇省南京市南京大學(xué)醫(yī)學(xué)分子技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210093）

目的了解FOG2（Friend of G AT A4）基因外顯子突變在中國圓錐動脈干發(fā)育畸形（C T D）病人中情況和比例，以及在T O F病人中，檢測是否存在FOG2基因的拷貝數(shù)量變化。方法在南京市兒童醫(yī)院收集從2004年1月到2006年1月的199例C T D病人的血樣，包括145例法洛四聯(lián)癥（T O F），37例右心室雙出口（D O R V），17例大動脈錯位（T G A）。100例健康患者作為對照組，利用一代測序檢測FOG2基因的外顯子突變，利用多重連接探針擴(kuò)增（ML P A）檢測FOG2基因的拷貝數(shù)量變化。結(jié)果在6個C T D病人發(fā)現(xiàn)了4種錯義突變，分別在2個D O R V病人中發(fā)現(xiàn)了p.V339I、p.A426 T 3個T O F病人中發(fā)現(xiàn)了p.M703L，在1個T O F病人中發(fā)現(xiàn)了p.T843。總比例為3.0%。所有的這些突變都并沒有在100個正常人中發(fā)現(xiàn)。ML P A檢測沒有發(fā)現(xiàn)在T O F病人中存在著拷貝數(shù)量變化。結(jié)論FOG2基因的外顯子突變在中國C T D病人中是相對比較常見的，而FOG2基因的拷貝數(shù)量變化不是引起C T D的原因。但依然需要更大樣本的研究來提高我們對FOG2基因在C T D中的作用的認(rèn)識。

圓錐動脈干發(fā)育畸形；FOG2基因；突變；拷貝數(shù)量變化

圓錐動脈干發(fā)育畸形（conotruncal heart defect，C T D）是一種先天性心臟?。╟ongenital heart disease，C H D），在新生兒的發(fā)生率為1／1000［1］。C T D主要包括法洛四聯(lián)癥（tetralogy of Fallot， T O F），大動脈錯位（transposition of great artery，T G A）和右心室雙出口（double-outlet ventricle outflow，D O R V）。圓錐動脈干發(fā)育畸形屬于先天性心臟病的一種復(fù)雜類型，一經(jīng)診斷，需要對患者進(jìn)行手術(shù)修復(fù)治療。雖然大多數(shù)圓錐動脈干發(fā)育畸形的病因至今依然不清楚，但是有不少研究表明，遺傳因素在C T D的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。實際上，大約12%的C T D被認(rèn)為是由22q11微缺失引起的［2-7］。

FOG2基因編碼一張鋅指蛋白，包含1151個氨基酸和8個鋅指結(jié)構(gòu)域。FOG2蛋白為一種轉(zhuǎn)錄輔因子，與下游蛋白G AT A4結(jié)合形成復(fù)合物，在心臟的發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用［8］。FOG2基因敲除小鼠表現(xiàn)出異常的心臟發(fā)育，其中包括C T D［9］。G AT A4基因突變的小鼠影響了G AT A與FOG2蛋白的結(jié)合，從而表現(xiàn)出與FOG2基因敲除小鼠相似的表型［10］。Pizzuti等［11］首次在47例T O F病人中發(fā)現(xiàn)了FOG2基因的兩個錯義突變，但對突變的功能研究顯示并不影響G AT A4與FOG2蛋白的結(jié)合，而且FOG2蛋白的表達(dá)幾乎沒有變化。隨后的兩個研究在C T D病人中又發(fā)現(xiàn)了一些突變，主要存在于D O R V的病人中，但他們都沒有進(jìn)一步的對FOG2基因突變的致病機(jī)制進(jìn)行研究［12，13］。而在這些研究選用的人群，主要是歐美人群，而在中國人群，甚至亞洲人群中，F(xiàn)OG2基因在C T D病人中的突變情況，目前還沒有報道。

另一方面，拷貝數(shù)量變化（copy nu m ber variation，CNV），是由于基因組重排導(dǎo)致的主要結(jié)構(gòu)變異類型，包括亞顯微結(jié)構(gòu)下大于1kb基因片段的缺失和重復(fù)。CNV被認(rèn)為是影響人類疾病的主要遺傳因素之一，突變頻率比單核苷酸多態(tài)性（SNP）高的多。CNV證實與孟德爾遺傳疾病、散發(fā)性疾病和復(fù)雜疾病的易感性有關(guān)，通過改變相關(guān)基因的劑量產(chǎn)生臨床表型。各種機(jī)制參與CNV的形成，主要分為兩大類：以DNA重組為基礎(chǔ)和DNA復(fù)制為基礎(chǔ)［14］。Steven等［15］對114例T O F病人進(jìn)行全基因組掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了有11個位點存在拷貝數(shù)量變化，因此，不能排除在T O F病人中存在著FOG2基因的拷貝數(shù)量變化。

1 材料與方法

1.1 基本資料 從2004年1月至2006年1月，在南京市兒童醫(yī)院收集了199例C T D的病人，包括145例T O F，37例D O R V，17例T G A。C T D的診斷是以超聲心動圖為標(biāo)準(zhǔn)，并在手術(shù)中得以證實，而且排除了帶有其他心臟畸形的病人。在鼓樓體檢中心收集100例健康人的血樣，這些病人沒有先天性心臟病的病史并且超聲心動圖檢查沒有心臟結(jié)構(gòu)的異常。所有的C T D病人和正常人都利用Qiagen試劑盒提取出外周血樣中的DNA。

1.2 DNA測序和生物信息學(xué)分析 人類FOG2基因位于8q23.1，包含8個外顯子。8個外顯子以及剪接區(qū)域利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，利用Primer 3.0軟件設(shè)計FOG2基因的14對特異性引物，其中7對對應(yīng)FOG2基因的8號外顯子。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用Gel Extraction Kit（O mega）進(jìn)行純化，BigDye Terminator v3.1 Kit進(jìn)行循環(huán)測序，并且利用ABI 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）進(jìn)行分析。

FOG2基因突變位點的確定從GenBank獲?。ǖ卿浱枺篘 C＿000008.10），并利用美國國家生物技術(shù)信息中心（NationaLCenter for Biotechnology Information，N C BI）人類SNP數(shù)據(jù)庫（hu man SNP database，dbSNP）、千人基因項目數(shù)據(jù)庫（1000 Geno me Project database）以及外顯子測序項目（Exo me Sequencing Project，ESP）確認(rèn)新發(fā)現(xiàn)的突變。其他物種的FOG2蛋白序列是從N C BI GenBank中獲取的，保守性分析利用Clustalw2軟件進(jìn)行分析。突變對基因結(jié)構(gòu)和功能的影響利用PolyPhen-2進(jìn)行預(yù)測。

1.3 多重鏈接探針擴(kuò)增（m ultiplex ligation-dependent probe a m plification，ML P A） FOG2基因的外顯子探針是用H-MAP D（H u manMLP AProbe Design）軟件進(jìn)行設(shè)計的。ML P A的步驟為：雙鏈DNA分離：100 ng DNA95℃孵育5 min；雜交：分離后的DNA與探針混合，60℃孵育16～18小時；連接：加入連接酶，54℃孵育15 min；擴(kuò)增：PCR（35 cycle，95℃30 s，60℃30 s，72℃60 s，72℃20 min）。ML P A的產(chǎn)物在ABI 3100 Genetic Analyzer進(jìn)行分離，利用Gene Mapper軟件（Appied Biosystem）進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

在6個C T D病人發(fā)現(xiàn)了4種錯義突變，其中分別在2個D O R V病人中發(fā)現(xiàn)了p.V339I、p.A426 T，3個T O F病人中發(fā)現(xiàn)了p.M703L，1個T O F病人中發(fā)現(xiàn)了p.T843 M，總的比例為3.0%（圖1）。對照組中100個正常人中沒有發(fā)現(xiàn)以上的突變。其中，p.V339I、p.M703L已經(jīng)在先前的報道中被發(fā)現(xiàn)，p.A426 T、p.T843 M是我們研究首次在C T D病人中報道的突變。p.A426 T、p.M703L、p.V339I能在dbSNP和千人基因組數(shù)據(jù)庫中找到（rsID：rs35843564、rs121908603、rs201845067），p.A426 T和p.V339I能在ESP數(shù)據(jù)庫中找到，但p.T843 M沒有在任何數(shù)據(jù)庫中找到，是一個新的突變。另外，我們發(fā)現(xiàn)的這4種突變，在其他物種中也是高度保守的（圖2）。利用PolyPhen2對這4個突變對蛋白功能和結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行預(yù)測，p.V339I和p.A426T被預(yù)測為良性突變，而p.M703L和p.T843 M則被預(yù)測為可能引起疾病的突變，見表1。

圖1 所發(fā)現(xiàn)的4種錯義突變，（a）～（d）：V339I，A426 T，M703L，T843 M

表1 所發(fā)現(xiàn)的4種錯義突變以及它們的特點

圖2 不同物種間的保守序列分析，方框中表示突變的位點，從左到右為M703L，T843 M，V339I和A426 T

在145例T O F病人的ML P A檢測中，所有的外顯子中都檢測到正常范圍的ML P A信號，這一結(jié)果排除了拷貝數(shù)量變化在FOG2基因引起C T D發(fā)病機(jī)制中的作用，見圖3。

圖3 MLP A探針的電泳效果圖，F(xiàn)OG2基因所有的外顯子都在相應(yīng)的波峰下標(biāo)出

3 討 論

1999年，Svensson等［8］研究發(fā)現(xiàn)小鼠FOG2蛋白能在體內(nèi)和體外與G AT A4的N端鋅指特異性相結(jié)合。通過特異性結(jié)合，F(xiàn)OG2能調(diào)節(jié)G AT A4的轉(zhuǎn)錄活性，因為在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和大鼠的心肌細(xì)胞中，F(xiàn)OG2基因的過表達(dá)能抑制Gata4依賴性的轉(zhuǎn)錄過程。2000年，該研究組運(yùn)用基因定位突變的方法來探究FOG2基因在正常心臟發(fā)生中的功能。研究顯示FOG2基因缺陷的小鼠在胚胎期的第13天因為充血性心力衰竭而死亡，表現(xiàn)為一種三尖瓣閉鎖綜合征，包括三尖瓣的缺失、嚴(yán)重的房間隔缺損、室間隔缺損、左心室流出道的延長、主動脈瓣向右移位和肺動脈狹窄。這些FOG2基因缺陷的小鼠在發(fā)育中同時也存在著左心室發(fā)育不全。該研究展示了FOG2在正常心臟的瓣膜發(fā)育中的重要作用以及提示了三尖瓣閉鎖綜合征的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

2000年，Tevosian等［9］通過敲除小鼠的FOG2基因來獲得Fog2-／-小鼠，敲基因小鼠在胚胎形成的中期死亡，表現(xiàn)出嚴(yán)重的心血管畸形，包括共同房室通道、心室肌發(fā)育不良、冠狀動脈缺失和法洛四聯(lián)征。另外，在Fog2-／-小鼠的心臟中，冠狀動脈發(fā)生非常明顯的缺失。而使FOG2在心肌細(xì)胞中重新表達(dá)能修復(fù)Fog2-／-小鼠的血管表型，進(jìn)一步展示了Fog2基因在心肌中的作用以及在冠狀動脈的發(fā)育中至關(guān)重要。

2001年，Crispino等［10］建立了使Gata4蛋白單個氨基酸被取代的小鼠模型，削弱其與FOG2蛋白的相互作用。這些小鼠在胚胎期的第12天死亡，表型與Fog2-／-小鼠相似，除了G AT A4突變小鼠還存在半月瓣的畸形和雙右室流出道。此項研究提示Gata4的功能依賴于FOG2蛋白和另一種心臟特異性FOG蛋白間的相互作用。

FOG2基因突變大多是外顯子的錯義突變、同義突變、移碼突變，以及5’U T R區(qū)的變異、非編碼的外顯子的變異、內(nèi)含子剪接異常、外顯子無義突變形成額外的終止密碼子和起始密碼子，造成蛋白的截短或延長等。它的單個或多個基因的突變或異常表達(dá)均會導(dǎo)致心血管發(fā)育異常，影響心臟畸形的發(fā)生。

2003年，Pizzuti等［11］對47個T O F患者的FOG2基因進(jìn)行測序，在其中2個患者中發(fā)現(xiàn)了各發(fā)現(xiàn)了1個突變（S657 G、E30 G）。2011，De Luca等［12］在1個散發(fā)的雙右室流出道的病人中，同樣發(fā)現(xiàn)了FOG2基因上E30 G這一突變。2005年，Ackerman等［16］在30個死亡的膈肌有缺陷的兒童中，在4號外顯子上發(fā)現(xiàn)了一個突變（R112X），尸體解剖顯示患者具有肺發(fā)育不良和先天性膈疝。該研究提示FOG2基因這個突變可能會引起原發(fā)性的肺部和膈肌缺陷。2007年，Bleyl等［17］在96個先天性膈疝的病人中發(fā)現(xiàn)了FOG2基因7號外顯子上的2個突變（M703L和T843 A）。2012年，Tan等［13］在一個雙右室流出道患者中發(fā)現(xiàn)了同樣的突變（M703L）。2011年，De Luca等［12］在1個散發(fā)的雙右室流出道的病人中發(fā)現(xiàn)了FOG2基因6號外顯子的一個突變（I227 M），另外，在1個散發(fā)的T O F病人中，在FOG2基因8號外顯子上發(fā)現(xiàn)了另外一個突變（M544I）。2012年，Tan等［13］在1個雙右室流出道合并室間隔缺損的新生兒中，發(fā)現(xiàn)了FOG2基因8號外顯子上的一個突變（K737E）。

到目前為止，國內(nèi)外主要報道了13種導(dǎo)致先天性心臟病的FOG2基因突變，其中大多數(shù)都發(fā)生在多個不相干的家庭。FOG2基因突變在C T D病人中所占的比例大約為4%，與我們的結(jié)果相似（3%）。

另一方面，雖然FOG2基因的拷貝數(shù)量變化在我們的研究中沒有發(fā)現(xiàn)，但拷貝數(shù)量變化作為一種重要的疾病發(fā)展發(fā)生機(jī)制，其對于圓錐動脈干發(fā)育畸形這種發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未明確的先天性疾病，仍可能存在相當(dāng)重要的作用，特別是Alu序列豐富的基因區(qū)域，目前與圓錐動脈發(fā)育畸形相關(guān)的主要基因主要有G AT A4，JAG-1，F(xiàn)OG2，G AT A6，T B X-1等，這些基因?qū)τ诳截悢?shù)量變化的檢測目前國際上還是相當(dāng)缺乏，而我們的檢測中沒有得到陽性結(jié)果的原因，除了可能FOG2基因拷貝數(shù)量變化不是發(fā)生C T D的機(jī)制外，還可能由于樣本數(shù)量太少，檢測技術(shù)靈敏度和特異性不夠強(qiáng)，所選擇的區(qū)域中沒有拷貝數(shù)量變化等。因此，依然需要更大樣本，更多中心的研究來加強(qiáng)我們對圓錐動脈干發(fā)育畸形拷貝數(shù)量變化情況的認(rèn)識。

2011年，Tan等［13］通過對FOG2基因與T O F發(fā)生的特異性和敏感度分析顯示，雖然其靈敏度不高，但有較高的特異性，據(jù)此可以為FOG2基因在T O F的產(chǎn)前診斷和基因治療提供依據(jù)。FOG2基因是心臟發(fā)育過程中較早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，與G AT A4相互作用貫穿心臟發(fā)育的全過程，在心臟的發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。該基因發(fā)生變異將可能導(dǎo)致先天性膈疝、法洛四聯(lián)癥（T O F）或雙右室流出道（D O R V），對于妊娠期的婦女，特別是帶有明顯家族史的婦女，通過抽取產(chǎn)前絨毛組織或羊水，進(jìn)行FOG2基因篩查，結(jié)合胎兒超聲心動圖的檢查，提早發(fā)現(xiàn)心臟發(fā)育異常的胎兒，爭取早期治療和終止妊娠的機(jī)會，減輕家庭負(fù)擔(dān)和社會負(fù)擔(dān)。

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編輯：熊詩詣

ObjectiveTo understand the role of FOG2 gene in patients with conotruncal heart defect and find exon m utations and copy nu m ber variants of FOG2 gene.MethodFro m January 2004 to January 2006，blood sam ples were collected from 199 C T D patients w ho were ad mitted to Nanjing Children’s H ospital，Jiangsu Province，including 145 T O F，37 D O R V and 17 T G A.Sequencing was used to detect exon m utations and MLP Awas used to detect copy nu m ber variants of FOG2 gene in C T D patients.Results4 missense m utations were identified in 6 patients with conotruncal heart defect.p.V339I and p.A426 T were identified in 2 patients with D O R V，p.M703L wasidentified in 3 patients with T O Fand p.T843 was identified in 1 patients with T O F.MLP Asignals were allfound within the normal range values for all exons in all patients.ConclusionsFOG2 gene m utations are also com m on in C T D patients and major contribution of FOG2 gene CNVs was excluded in T O Fpathogenesis.But m ore studies with larger sam ples are still needed to enhance our understanding of the role of FOG2 gene.

conotruncal heart defect；FOG2 gene；m utation；copy nu m ber variant

R714.53

A

10.13470／j.cnki.cjpd.2014.02.006

2014-02-21）

*通訊作者：易龍，E-mail：18751851015＠163.com