張 曄，卞永生，劉進忠

（1. 承德醫(yī)學院，河北 承德 067000；2. 保定市第一醫(yī)院普外科，河北 保定 071000）

骨橋蛋白與CD44v6在結腸腺癌中的表達及其臨床意義

張 曄1，卞永生2，劉進忠2

（1. 承德醫(yī)學院，河北 承德 067000；2. 保定市第一醫(yī)院普外科，河北 保定 071000）

目的 研究結腸腺癌組織中骨橋蛋白和CD44v6的表達及其意義。方法 用免疫組化法檢測80例結腸腺癌組織（有淋巴結轉移32例，無淋巴結轉移48例）、30例結腸腺瘤組織、20例距結腸腫物（息肉、腺瘤、腫瘤等）5 cm以上的正常組織中骨橋蛋白和CD44v6的表達水平，并分析骨橋蛋白與CD44v6在結腸腺癌中表達的相關性。結果 在結腸腺癌組織及其周圍淋巴結中，骨橋蛋白和CD44v6的表達水平顯著高于正常結腸組織和結腸腺瘤組織的表達水平（P＜0.05）,在有轉移的結腸腺癌中骨橋蛋白與CD44v6的表達水平顯著高于無轉移的結腸腺癌組織（P＜0.05）。結腸腺癌組織中骨橋蛋白的表達與CD44v6 的表達具有一致性（P＜0.05）。結論 骨橋蛋白和CD44v6與結腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展相一致，骨橋蛋白與CD44v6聯(lián)合檢測對于明確結腸腺癌發(fā)展及預后提供一定依據(jù)，對臨床診治具有一定指導意義。

結腸腺癌；腫瘤轉移；骨橋蛋白；CD44v6；免疫組織化學

結腸癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，近年來中國結腸癌的發(fā)病率及病死率均逐漸上升，復發(fā)及轉移是結腸癌致死的主要原因。而結腸癌的病理表達中結腸腺癌占大部分比例。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種具有多種功能分泌型鈣結合磷酸化糖蛋白，與腫瘤細胞的轉化、浸潤和轉移相關，并通過與整合素受體、CD44受體的結合來調(diào)節(jié)細胞基質(zhì)相互作用和信號轉導，使細胞無限制增殖，形成腫瘤[1]。CD44是分布極為廣泛的細胞表面跨膜蛋白，同時是一條糖基化的跨膜多糖鏈。CD44v6作為其配體在這個過程中起到重要作用。目前，OPN與CD44v6在結腸腺癌組織中表達狀況的文獻較少。對OPN、CD44v6在結腸腺癌中的表達水平進行研究，旨在初步了解其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 資料

收集保定市第一醫(yī)院2005年1月至2012年12月經(jīng)病理學診斷證實為結腸腺癌標本80例,其中無淋巴結轉移48例，有淋巴結轉移32例。其中男47例，女33例；年齡35～80歲，平均年齡58歲。所有選取標本術前均未行任何相關治療。結腸腺癌標本均在癌灶中央取材，中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋， 4 μm 厚度連續(xù)切片。另取距結腸腫物（息肉、腺瘤、腫瘤等）5 cm以上的正常結腸組織20例和結腸腺瘤組織30例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

OPN 抗體（兔抗人單克隆抗體，上海江萊生物科技有限公司），工作液濃度為1∶150；CD44v6 （即用型，兔抗人單克隆抗體，福建邁新試劑公司）；免疫組化試劑盒（福建邁新試劑公司）。

1.2.2 實驗過程

免疫組化(SP) 法，標本石蠟切片, 厚度4 μm ,常規(guī)固定染色，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，中性樹膠封片。PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.3 陽性結果判定

OPN主要分布于細胞的細胞質(zhì)中，DAB染色為棕黃色。CD44v6于細胞膜染色呈棕黃色。判斷標準根據(jù)，按切片中陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的比例計分：0分，無陽性細胞顯染色；1分, 陽性細胞＜25%染色；2分,陽性細胞25%～50%染色；3分，陽性細胞＞50%染色。陽性反應由兩位高年資病理師獨立觀察每張切片后一起作出判斷。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理通過SPSS17.0統(tǒng)計軟件完成，采用Spearman等級相關分析OPN、CD44v6的相關性。計數(shù)資料采用χ2檢驗，當某一個理論數(shù)1＜T≤5時，須對χ2進行連續(xù)性校正，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同組織中OPN和CD44v6的表達

OPN、CD44v6 在細胞中表達定位觀察：免疫組化結果顯示，OPN主要表達于癌細胞胞質(zhì)中，呈強染色或中等染色，巢狀或片狀分布，部分腺腔上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞亦呈中等染色，間質(zhì)細胞中無或弱染色；而CD44v6主要在癌細胞胞膜上表達，胞質(zhì)內(nèi)偶見棕黃色顆粒，間質(zhì)中幾乎無陽性細胞。OPN在80例結腸腺癌組織中58例表達，30例結腸腺瘤組織中和20例正常結腸組織分別有7例和0例陽性表達。陽性表達率分別72.5%、23.3%和0.0%。CD44v6在結腸腺癌組織中64例表達，在結腸腺瘤組織中11例陽性表達，在正常結腸組織中1例陽性表達。陽性表達率分別是80.0%、25.6%和5.0%，見表1。在正常結腸組織和結腸腺瘤組織中OPN表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.426，P=0.02），在正常結腸組織和結腸腺癌中OPN表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=34.524，P＜0.001），在結腸腺瘤和結腸腺癌中OPN表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=22.818，P＜0.001）。在正常結腸組織和結腸腺瘤組織中CD44v6表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.579， P=0.01），在正常結腸組織和結腸腺癌中CD44v6表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=39.560，P＜0.001），在結腸腺瘤和結腸腺癌中CD44v6表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=18.885，P＜0.001）。

表1 OPN、CD44v6在不同結腸組織中的表達

2.2 結腸腺癌中骨橋蛋白和CD44v6與臨床及病理特征之間的關系

經(jīng)統(tǒng)計學分析，OPN與CD44v6的表達與結腸腺癌的淋巴結轉移差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 結腸腺癌中OPN和CD44v6與淋巴結轉移的關系

2.3 結腸腺癌中OPN與CD44v6表達的相互關系

80例結腸腺癌中OPN與CD44v6均陰性表達為8例，均陽性表達為56例。OPN陰性且CD44v6表達陽性的14例。OPN陽性且CD44v6表達陰性的8例。通過Spearman相關分析，結腸腺癌中OPN表達與CD44v6的表達存在正相關，隨著結腸腺癌中OPN陽性表達的增強，CD44v6的陽性表達逐漸增高（r=0.252，P＜0.05）。

3 討 論

OPN是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一種與惡性腫瘤發(fā)展、轉移有關的磷酸化蛋白。研究表明，OPN的過量表達與肝癌、膽囊癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤惡性程度、轉移、早期復發(fā)等有密切關系，OPN陽性表達患者的預后比陰性表達患者生存率低[2-3]；原發(fā)腫瘤在促進轉移方面是多方面協(xié)同發(fā)生的，其中一方面是分泌一些如OPN的因子促進腫瘤的外侵及轉移[4]。在肝癌的研究[5]中發(fā)現(xiàn)，OPN mRNA 的過表達與腫瘤的分化、分級及早期復發(fā)有密切關系，并且可以作為判斷預后的指標和預測早期復發(fā)的標志。體外試驗[6]發(fā)現(xiàn)，大部分癌細胞株和癌組織中均有OPN高表達，隨著癌細胞株侵襲能力的增強，細胞中OPN信使RNA的表達量也相應增加。本研究證明，OPN表達與結腸腺癌有無淋巴結轉移有相關性；有淋巴結轉移者OPN的陽性表達率比無淋巴結轉移者升高，證明OPN的高表達與結腸腺癌的病變發(fā)展及預后密切相關。而且本研究證明，OPN的表達與取材標本的年齡、性別及腫瘤大小無關，與Pan等[5]在OPN肝癌中的研究結論相一致。

CD44是一種細胞表面跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，其在細胞外基質(zhì)中與透明質(zhì)酸結合，維持組織或器官的結構，促進細胞浸潤和介導細胞遷移。CD44廣泛分布于細胞表面，是細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)相互識別和作用的分子基礎。CD44又是一種特異性淋巴細胞歸巢受體，在多種高轉移性腫瘤細胞上表達，CD44陽性的瘤細胞可能因獲得類似淋巴細胞成分的偽裝，而容易進入淋巴結形成轉移灶。CD44基因與許多腫瘤的浸潤和轉移有關[7]。研究[8]表明，CD44表達與結直腸癌發(fā)生、淋巴結轉移和患者預后密切相關。CD44因存在多種編碼的外顯子而存在多種變異型表達。有研究[9]表明，含有v6外顯子的CD44變異性表達與結腸癌的浸潤及轉移密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6在結腸腺瘤和無轉移結腸腺癌組織中及有轉移的結腸腺癌中的陽性表達率逐步升高，與OPN表達具有一致性。

OPN通過其特有的RGD結構與整合素結合，通過非依賴RGD結構的方式與CD44結合。雙變量相關性分析顯示，OPN和CD44v6的表達有明顯相關性，說明兩者在結腸腺癌的侵襲轉移中有相互促進作用。有研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生機制可能是OPN與CD44v6相結合后促使腫瘤細胞發(fā)生趨化黏附和浸潤轉移，并導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并促進其轉移。其結果與Sun等[10]研究的OPN和CD44v6結合，是一種新型非小細胞肺癌患者根治術預后的標志物相一致 。但其確切的發(fā)生機制還有待于進一步研究。綜上所述，聯(lián)合檢測OPN和CD44v6在結腸腺癌中的表達有助于臨床對判斷結腸腺癌臨床治療及愈后和復發(fā)等具有參考價值。

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（責任編輯：劉俊華）

Expression of osteopontin and adhesion molecule CD44v6 in colon adenocarcinoma and their clinical significance

ZHANG Ye1, BIAN Yongsheng2, LIU Jinzhong2
(1. Chengde Medical College, Chengde 067000, China; 2. General Surgery, The First Hospital of Baoding, Baoding 071002, China)

Objective To investigate expression of osteopontin (OPN) and adhesion molecule CD44v6 in colon adenocarcinoma and their clinical significance. Methods 80 cases of colon cancer tissue were detected by immunohistochemical methods (with lymph node metastasis in 32 cases, 48 cases without lymph node metastasis), 30 cases of colorectal adenoma, 20 cases from colon tumor (polyp, adenoma, cancer, etc.) 5 cm above normal tissue osteopontin and CD44v6 expression levels were examined to analyze the correlation of osteopontin and CD44v6 expression in colon adenocarcinoma. Results Adenocarcinoma of the colon and surrounding lymph nodes, osteopontin and CD44v6 expression were significantly higher than that of normal colon tissue and colonic adenoma expression levels (P＜0.05), colon adenocarcinoma with metastasis in osteopontin CD44v6 protein expression levels were significantly higher than that of non-metastatic colon adenocarcinoma (P＜0.05). Colon adenocarcinoma osteopontin expression and expression of CD44v6 were in a state of consistency (P＜0.05). Conclusion OPN-CD44v6 with colon adenocarcinoma, developing consistent, osteopontin and CD44v6 joint detection for colon cancer development and prognosis explicitly provide a basis for clinical diagnosis and treatment , which has a certain significance in clinical practices.

colon adenocarcinoma; tumor metastasis; osteopontin; CD44v6; immunohistochemistry

R36

A

1674-490X(2014)01-0024-04

2013-11-20

張曄（1981—），男，河北邢臺人，在讀碩士，主要從事普外科的臨床和科研。E-mail: 63435382@qq.com

卞永生（1963—），男，河北衡水人，教授，碩士生導師，主要從事肝膽外科的臨床和科研。E-mail: 630067812@qq.com