曹麗軍，楊 靖，耿鳳珍，李慧卿，史 崢，時東彥

（1. 河北大學附屬醫(yī)院檢驗科，河北 保定 071000；2. 河北省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000；3. 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000）

攜帶NDM-1陰溝腸桿菌尿路感染株臨床特點回顧性報告

曹麗軍1，楊 靖2，耿鳳珍1，李慧卿1，史 崢1，時東彥3

（1. 河北大學附屬醫(yī)院檢驗科，河北 保定 071000；2. 河北省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000；3. 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000）

…目的 對2012年7月分離自住院患者尿液標本攜帶NDM-1陰溝腸桿菌的臨床特點、檢測過程進行回顧性分析，探討其耐藥特征及產(chǎn)生機制，對控制“超級細菌”的流行提出意見。方法 依照CLSI標準，采用K-B法和MIC法檢測耐藥性，改良Hodge試驗和金屬酶試驗檢測產(chǎn)酶類型，聚合酶鏈反應(PCR)檢測耐藥基因并進行測序。 結果 此株陰溝腸桿菌對亞胺培南和美羅培南等15種7個類別抗生素均顯示耐藥，改良Hodge試驗陽性，金屬酶表型初篩試驗陽性，經(jīng)基因擴增并測序后，與Genebank比對，表明與NDM-1基因有99%的相似性,并經(jīng)河北省CDC確證報告該菌株為攜帶NDM-1陰溝腸桿菌。結論 該尿路感染攜帶NDM-1基因金屬酶的陰溝腸桿菌株，其產(chǎn)生可能與患者年老體差、惡性腫瘤伴長時滯留尿管并長時多次應用過多種抗生素有關，因此特別強調(diào)嚴格侵入性導尿及滯留時限指征、規(guī)范抗生素使用，做好重點消毒、隔離，控制多重耐藥株發(fā)生。

陰溝腸桿菌；碳青霉烯類抗生素；NDM-1基因檢測；回顧性報告

NDM-1細菌又名-新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1（New Delhi Metallo-β-lactamase-1，blaNDM-1）或者簡稱NDM-1，也即所謂的“超級細菌”，這種超級細菌多對所有治療重癥感染的抗生素包括碳青霉烯類（carbapenes）在內(nèi)的各類β-內(nèi)酰胺類抗生素都具有很高的抗藥性，已引起了世界范圍的廣泛關注[1-2]。選擇2012年7月在河北大學附屬醫(yī)院住院患者臨床送檢的尿液培養(yǎng)標本中分離出的泛耐藥陰溝腸桿菌作為研究對象，通過回顧菌株檢測過程，探討其耐藥產(chǎn)生原因，倡導嚴格、規(guī)范抗生素使用指征，對控制“超級細菌”的發(fā)生有指導意義。

1 一般資料與方法

1.1 一般資料

菌株來源及病例簡介：陳寶X，男，83歲，漢族，河北省保定市人，企業(yè)退休，糖尿病腎病、乙肝、肝硬化失代償期、2011年確診原發(fā)性肝癌晚期，在保定市某社區(qū)醫(yī)院住院8個月余，期間間斷性使用抗生素Ⅰ聯(lián)-Ⅲ聯(lián)不等，后因病情惡化（發(fā)熱、昏迷）轉(zhuǎn)入河北大學附屬醫(yī)院消化科住院?；颊咿D(zhuǎn)院過程中即帶有鎖骨靜脈插管和尿道插管，在轉(zhuǎn)院過程中導尿管脫落，因患者睪丸及尿道口過于腫大，入院后請泌尿外科醫(yī)師會診并行導尿管植入術，同時留取尿液細菌培養(yǎng)，連續(xù)3次均培養(yǎng)出包括亞胺培南、美羅培南耐藥的泛耐藥陰溝腸桿菌。入院21 d終因年老、體弱、惡性腫瘤伴糖尿病腎病等疾病導致多器官衰竭病故。

1.2 儀器與試劑

vitek生化鑒定條（法國生物梅里埃公司）；美國BD PHOENIX-100全自動細菌鑒定藥敏儀；PCR擴增儀（美國BIO-RAD公司）；PCR試劑（上海生物工程有限公司）；高速冷凍離心機（美國Thermo公司）；DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藥物敏感試驗

采用WHO推薦的K-B紙片擴散法[3]和美國BD PHOENIX-100全自動細菌鑒定藥敏儀MIC藥敏實驗。藥敏紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品，結果判讀依照CLSI 2012版[4]判斷標準。藥敏室內(nèi)質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3.2 改良Hodge試驗

將0.5麥氏單位的大腸埃希菌ATCC25922菌液1∶10稀釋后均勻涂布在MH平皿上，中間貼美羅培南紙片，將實驗菌株以美羅培南紙片為起點，沿離心方向劃線，35 ℃ 培養(yǎng)過夜，抑菌圈內(nèi)呈現(xiàn)出矢狀者為陽性。肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705作為陽性對照，ATCC BAA1706作為陰性對照。

1.3.3 金屬酶表型初篩試驗

陰溝腸桿菌配成0.5麥氏單位的菌液，均勻涂布于MH平板上，平板上分貼2片美羅培南（10 μg）紙片，并在其中一片美羅培南紙片上滴加EDTA（0.5 μmol）10 μL，35 ℃ 孵育18 h，觀察各紙片抑菌環(huán)大小，如果加酶抑制劑與不加酶抑制劑的抑菌環(huán)直徑相差大于5 mm為金屬酶實驗陽性。

1.3.4 基因擴增

分別用blaIMP、blaVIM、blaNDM、blaKPC、blaCTX-M等β內(nèi)酰胺酶基因及外膜蛋白基因進行PCR擴增（表1）。

表1 PCR引物序列及擴增片段

1.3.5 測序與序列比對

PCR擴增產(chǎn)物由上海生物工程公司純化后雙向測序，序列經(jīng)BLAST比對分析，以明確基因型。

2 結 果

2.1 藥物敏感試驗

該株菌對所有檢測的β-內(nèi)酰胺類抗生素、加酶抑制劑類抗生素、四環(huán)素類、磺胺類及氯霉素類等多種抗生素均顯示耐藥，對氨基糖苷類抗生素中阿米卡星敏感，喹諾酮類抗生素中左旋氧氟沙星敏感。

表2 K-B法及MIC法藥敏試驗結果

2.2 碳青霉烯酶篩選試驗

改良Hodge實驗結果顯示陽性，金屬酶表型初篩試驗檢測陽性。

2.3 基因檢測

NDM-1 基因的核心序列PCR 擴增后，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldview 染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，顯示核心序列為陽性，結果見圖1，與Genbank比對有99.99%的相似性。比對結果見圖2。blaIMP、blaVIM、blaKPC、blaCTX-M和OMPK36基因檢測均為陰性。

圖1 基因擴增產(chǎn)物電泳

3 討 論

3.1 “超級細菌”感染局限，主動篩查，正確干預，可控可防

近年來，攜帶NDM-1的多重耐藥菌是倍受全球關注的公共衛(wèi)生問題之一。在中國也陸續(xù)出現(xiàn)攜帶NDM-1菌株的感染報道，這些菌株出現(xiàn)的地理位置分布涵蓋了中國的東、南和西部，地域分布的跨度比較大，并以腸桿菌科細菌為主，如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌等[5-8]。但是截止目前，媒體所報道的攜帶NDM-1的多重耐藥菌感染多為偶發(fā)事件，從“超級細菌”發(fā)現(xiàn)后的幾年跡象來看，其感染發(fā)生不具有普遍性或廣泛性，在傳播上有局限性[1，8]。本報告發(fā)現(xiàn)的這株陰溝腸桿菌是河北地區(qū)醫(yī)院內(nèi)首先報告的攜帶NDM-1基因的高水平泛耐藥陰溝腸桿菌。本院細菌室一經(jīng)發(fā)現(xiàn)該泛耐藥菌株后即刻通知感染控制辦公室和相關主管醫(yī)生及病區(qū)護士長，啟動感染控制應急措施，迅速對患者和其病房內(nèi)所觸及物品采取了重點常規(guī)消毒和單間隔離措施，對所住病房有特殊標示，建議出入該病房的醫(yī)護人員及陪護家屬加強防護和手衛(wèi)生，患者去世后對所住病房進行了終末消毒處理。由于醫(yī)院采取了適當?shù)拇胧?，該病區(qū)在其后的住院患者中尚未分離到同種或同類菌株。說明此“超級細菌”是可控可防的，及時采取正確的干預措施能夠起到殺菌、抑菌或控制作用的，不必引起恐慌。

3.2 嚴格指征，個性化規(guī)范治療是預防或控制多重耐藥菌產(chǎn)生或感染發(fā)生的重要舉措

回顧分析本感染病例不難得出，年老、體弱，惡性腫瘤，尤其惡腫治療削弱了人體免疫系統(tǒng)，且各種導管的使用使得細菌進入血液循環(huán)的機會大大增加， 個體免疫功能的缺失，侵襲性導尿管的應用和抗生素的不規(guī)范使用等都是誘發(fā)多重耐藥菌產(chǎn)生甚至感染發(fā)生的重要危險因素，因此，對患者進行相應的操作時，必須明確指征，及時拔管；同時必要的行政手段和專題講座，經(jīng)常性的感染醫(yī)師與微生物專業(yè)技師的對話溝通、查房或感染病例討論、經(jīng)驗介紹等對規(guī)范使用抗生素，嚴格抗生素使用指征，并全程按嚴格規(guī)范進行治療，也是預防或控制多重耐藥菌產(chǎn)生或感染發(fā)生的重要舉措。

[1] 孫長貴. 產(chǎn) NDM-1 酶細菌研究進展[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學雜志, 2011, 29(2): 99-101.

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[5] 鄒明祥, 鄔靖敏, 李軍, 等. 產(chǎn) NDM-1 肺炎克雷伯菌中國分離株的初步研究[J]. 中國當代兒科雜志, 2012, 14(8): 616-621.

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(責任編輯：高艷華)

Retrospective report of clinical characterizations of an Enterobacter cloacae carrying NDM-1 associated with urinary tract infection

CAO Lijun1, YANG Jing2, GENG Fengzhen1, LI Huiqing1, SHI Zheng1, SHI Dongyan3
(1. Department of Laboratory Medicine, the Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. Clinical Central Laboratory of Hebei Province, Shijizhuang 050000, China; 3. Department of Laboratory Medicine, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijizhuang 050000, China)

Objective A retrospective analysis in terms of clinical characteristics and detection was carried out for a case of Enterobacter cloacae bearing NDM-1 isolated from a urine specimen of an in-patient in our hospital in July 2012. The purpose of this paper was to render suggestions for controlling the epidemic of “superbugs”based on discussions regarding its antibiotic-resistant characterization and mechanism. Methods According to the recommendations of CLSI, susceptibility testing for antibiotics using K-B and MIC methods was performed. Carbapenemase production and its phenotypic were confirmed by modified Hodge test and metal-enzyme test. PCR for detecting and sequencing the antibiotic-resistance gene was also performed. Results This isolate was resistant to 15 antibiotics such as imipenem, meropenem and others which were classified into 7 categories. This isolation showed positive for modified Hodge test and screening test for detecting metal-enzyme phenotype. The DNA sequence of the isolation amplified by PCR showed 99% similarities comparing with NDM-1 gene cited in Genbank. It was confirmed as the first report of E. cloacae carrying NDM-1 by the CDC of Heibei Province.Conclusion The NDM-1-producing isolation may be related to the elder patient who was infirm, catheterized and experienced multi-drug treatments. Therefore, in order to lessen the incidents of multi-drug resistant strain, it is ideal that we should focus on the control over catheterization, the use of antibiotics and taking strict sterilization.

Enteroba cter cloacae; carbapenems antibiotics; NDM-1 gene detection; retrospective report

R446

A

1674-490X(2014)01-0033-04

2013-11-26

曹麗軍（1963—），女，河北安新人，副主任檢驗師，主要從事臨床微生物檢驗及細菌耐藥性檢測工作。E-mail: caolijun66@sina.com

時東彥（1973—），女，河北石家莊人，副主任檢驗師，博士，碩士生導師，主要從事臨床微生物檢測和細菌耐藥機制研究。E-mail: shidongyan73@126.com