林伯全，徐 磊，楊 慧，林秋敏

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，福州350119）

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum, MG）感染，也稱雞敗血霉形體感染或慢性呼吸道病(chronic respiratory disease, CRD)[1,2]。MG流行于全世界雞場(chǎng)中，在中國各省市雞群中也有很高的感染率，并造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。MG F株是一個(gè)良好的弱毒制苗菌株，已有很多相關(guān)的研究報(bào)道[6-8]。本試驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)及T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，研究了MG F株免疫后雞淋巴細(xì)胞亞類及T淋巴細(xì)胞增殖率的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為MG F株免疫機(jī)理的研究及更有效預(yù)防MG提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 疫苗株 MG弱毒F株由本實(shí)驗(yàn)室保存，活菌數(shù)達(dá)到109ccu/mL。

1.2 主要試劑及儀器 PE標(biāo)記的鼠抗雞CD3、CD4和CD8單克隆抗體（mAb）購自SoutherBiotech公司；鏈酶親和素標(biāo)記的磁球（MagCellect Streptavidin Ferrofluid）購自R&D Systems公司；紅細(xì)胞裂解液購于美國BD公司；PHA-P及MTT購自Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊锕こ坦?；流式?xì)胞儀為美國BD公司FASCalibur。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF種蛋于動(dòng)物飼養(yǎng)隔離器內(nèi)孵化，雛雞4日齡時(shí)，頸靜脈采血，選取MG抗體陰性的雛雞120羽。3 d后，隨機(jī)分為3組，每組40只，隔離飼養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將MG F株的新鮮培養(yǎng)物(109ccu/mL)分別以原倍和10-3稀釋(106ccu/mL)的2個(gè)不同活菌濃度的菌液，各用0.033 mL/只點(diǎn)眼接種7日齡SPF雞，分別為A、B組；使用生理鹽水點(diǎn)眼的SPF雞為C組。點(diǎn)眼前3 d及點(diǎn)眼后1、3、5、7、14、21、28 d，各組依次抽取不重復(fù)的5羽SPF雞，經(jīng)頸靜脈采集抗凝血，進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞類比值及T淋巴細(xì)胞增值率測(cè)定。所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析和最小顯著性差法（LSD）分析，P＜0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 淋巴細(xì)胞亞類比例的測(cè)定 經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定檢測(cè)方案，將肝素抗凝血150 μL與10倍稀釋的紅細(xì)胞裂解液1.5 mL，充分混勻，室溫放置5 min。用PBS洗滌除去紅細(xì)胞裂解液，然后用1.5 mL PBS重懸細(xì)胞，加入預(yù)先與MagCellect Streptavidin Ferrofluid結(jié)合的PE標(biāo)記的鼠抗雞CD3、CD4和CD8 mAb各10、3、5 μL，避光冰浴孵育30 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)樣品檢測(cè)10 000個(gè)淋巴細(xì)胞。

1.6 T淋巴細(xì)胞增值率測(cè)定 經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定檢測(cè)方案，將抗凝血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離，所得淋巴細(xì)胞用含100 mL/L犢牛血清的完全1640培養(yǎng)液配制成原始濃度為8×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每組設(shè)試驗(yàn)孔（淋巴細(xì)胞懸液150 μL、50 μg/mL PHA-P 50 μL)、對(duì)照孔(淋巴細(xì)胞懸液150 μL、完全RPMI-1640培養(yǎng)基50 μL)、空白孔(完全培養(yǎng)基200 μL)各3孔。將培養(yǎng)板置于40℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 15 μL，再培養(yǎng)4 h，然后每孔加入100 μL二甲基亞礬，10 min后用酶標(biāo)儀以490 nm為測(cè)量波長(zhǎng)，以630 nm為參考波長(zhǎng)，測(cè)得OD值。T淋巴細(xì)胞增值率用刺激指數(shù)（SI）表示，SI =（試驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）。

2 結(jié)果與討論

2.1 淋巴細(xì)胞亞類比例的測(cè)定 CD3+CD4+CD8-/CD3+比例，C組維持在31%左右；A組于免疫3 d后開始明顯增加，于d5、d7達(dá)到峰值（分別為46%、47%），并顯著高于其他組（P＜0.05）；B組于免疫5 d后開始明顯增加，于d7 達(dá)到峰值（39%），并顯著高于C組（圖1A）。

CD3+CD4-CD8+/CD3+比例，C組維持在17%左右；免疫7 d后，A組及B組開始明顯增加，都于d14達(dá)到峰值（分別為35%、26%）。其中，免疫后d7、d14，A組顯著高于B組（P＜0.05），B組顯著高于C組（P＜0.05）（圖1B）。

CD3+CD4+CD8-/ CD3+CD4-CD8+比例，A、B、C組均維持在1.7～1.8左右；各組差異不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1C）。

淋巴細(xì)胞亞類比例測(cè)定試驗(yàn)中，CD3+為T淋巴細(xì)胞，CD3+CD4+CD8－為Th細(xì)胞，CD3+CD4－CD8+為Tc細(xì)胞[9]。A組免疫3 d后，B組免疫5 d后，Th/T明顯增高，免疫7 d后A、B組均Tc/T明顯增高，表示Th和Tc在T細(xì)胞中的比例顯著增加，機(jī)體的抗感染免疫增強(qiáng)。Th/T、Tc/T由高至低依次為A、B、C組，免疫后d7，各組Th/T差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），免疫后d7、d14各組Tc/T差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Th/Tc是評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)的依據(jù)之一，是機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定最重要的指標(biāo)[10]，免疫后A、B、C組Th/Tc維持穩(wěn)定驗(yàn)證了MG F株免疫安全性。淋巴細(xì)胞亞類比例測(cè)定結(jié)果顯示MG F株可通過提高Th/T及Tc/T來提高雞的細(xì)胞免疫作用，且MG F 株活菌濃度與接種雞外周血Th/T、Tc/T呈正相關(guān)。

圖1 免疫后各組實(shí)驗(yàn)雞外周血淋巴細(xì)胞亞類的變化Fig. 1 Levels of lymphocyte subpopulations in PBMCs after vaccination

2.2 T淋巴細(xì)胞增值率測(cè)定 SI值，C組維持在1.3左右；A組于免疫d5開始明顯增加，于d 7、14達(dá)到峰值（都為1.9），并顯著高于其他組（P＜0.05）；B組于免疫7 d后開始明顯增加，于d14 達(dá)到峰值（1.6），并顯著高于C組（圖2）。

圖2 免疫后各組實(shí)驗(yàn)雞外周血T淋巴細(xì)胞增值率的變化Fig. 2 Levels of proliferation of lymphocytes in PBMCs after vaccination

SI反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的水平[11]，A、B組分別于免疫后d5、d7 后SI明顯增加，SI由高至低依次為A、B、C組，免疫后d14各組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示MG F株可通過提高SI來提高雞的細(xì)胞免疫作用，且MG F 株活菌濃度與接種雞外周血Th/T、Tc/T呈正相關(guān)。

本研究從淋巴細(xì)胞亞類比值及T淋巴細(xì)胞增殖率2個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)，免疫M(jìn)G F株可較好的提高雞的細(xì)胞免疫作用，且MG F 株活菌濃度與接種雞外周血Th/T、Tc/T呈正相關(guān)。

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