李 寧，孟春春，梁瑞英，李傳峰，陳宗艷，繆秋紅，畢莊莉，朱英奇，郭慧敏，劉光清，王桂軍

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥230016；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海2002411）

兔病毒性出血癥，又稱兔瘟，是由兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種以急性、高度傳染性、大面積壞死為特征的兔傳染病。據(jù)報(bào)道，兔病毒性出血癥于1984年首先在中國江蘇省爆發(fā)[1]，如今在美洲、歐洲和東南亞等世界范圍內(nèi)均有流行。該病潛伏期短、發(fā)病急、病程短、傳播快，多呈爆發(fā)性流行，給養(yǎng)兔業(yè)造成極大的威脅，世界衛(wèi)生組織局（OIE）將該病列為必須呈報(bào)疫病，我國將其列為二類疫病[2]。目前，國內(nèi)兔病毒性出血癥的臨床診斷普遍采用人的“O”型紅細(xì)胞進(jìn)行的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)，血凝檢測(cè)方法雖然有一定的優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在敏感性、生物安全性及準(zhǔn)確率較低等問題。而以兔出血癥病毒作為包被抗原的ELISA檢測(cè)方法，雖然特異性和敏感性較強(qiáng)，但其技術(shù)仍未達(dá)到成熟階段。

近年研究表明，RHDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60為病毒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白[3]，可作為ELISA檢測(cè)RHDV優(yōu)良的診斷抗原，陸續(xù)有報(bào)道通過VP60建立了兔瘟的ELISA檢測(cè)方法[4,5]。但RHDV完整的衣殼蛋白分子量偏大，同時(shí)在原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)得到的VP60蛋白表達(dá)量均偏低，而且表達(dá)效果不穩(wěn)定。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)VP60的優(yōu)勢(shì)抗原決定簇主要分布于兩端[6,7]，因此本研究選取RHDV衣殼蛋白VP60兩端的優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)域A（31～250 aa）和B（472～579 aa），采用融合PCR的方法將兩個(gè)片段擴(kuò)增拼接融合，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了RHDV重組多肽片段AB 蛋白，并以純化的蛋白為包被抗原建立RHDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法。另外利用完整VP60蛋白作為對(duì)比抗原[8]，比較兩種蛋白ELISA方法之間的差異，結(jié)果證明該融合蛋白保留了絕大部分VP60蛋白的抗原性，與完整的VP60蛋白相比可更好地與兔RHDV陽性血清特異結(jié)合。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研發(fā)出敏感、特異、安全、成本低廉、使用方便的RHDV診斷檢測(cè)試劑盒，對(duì)家兔免疫水平進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控和建立科學(xué)、靈活的家兔RHDV免疫程序奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 重組質(zhì)粒PBL-RHDV (含有RHDV全長基因組cDNA序列）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所劉光清課題組構(gòu)建并保存[9]；pET-30a(+)載體購自Novagen公司；E. coliJM109感受態(tài)細(xì)胞、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；

1.2 酶標(biāo)抗體與血清 抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體（MAb）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自Invitrogen公司；兔源陰性血清、陽性血清均由上海獸醫(yī)研究所劉光清課題組保存并提供。

1.3 酶與主要試劑 rTaqDNA 聚合酶、T4 DNA連接酶、Hind Ⅲ、KpnI等限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；細(xì)菌質(zhì)粒抽提試劑購自O(shè)mega公司；TMB顯色液、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自Beyotime公司；IPTG、尿素、包涵體蛋白純化試劑等均購自上海生工生物工程有限公司。

1.4 AB基因融合片段擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中收錄的RHDV JX/97株基因序列（登錄號(hào)：DQ205345）設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，且在引物5'端引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)（下劃線），各引物片段序列如下表1（黑體部分為P2/P3的互補(bǔ)區(qū)，引物由上海捷瑞生物工程公司合成）。

表1 構(gòu)建pET-30a(+)/AB重組質(zhì)粒所用引物Table 1 Primers used for constructions of pET-30a(+)/AB

以pBL-RHDV質(zhì)粒為模板，引物P1、P2擴(kuò)增A片段，引物P3、P4 擴(kuò)增B片段；分別將A、B片段回收后再用引物P1和P4進(jìn)行融合PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為AB。融合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物送生物公司測(cè)序鑒定，切膠后用純化回收試劑盒回收備用。

1.5 AB片段原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建 將純化的AB基因擴(kuò)增產(chǎn)物和pET-30a（+）載體分別用Kpn I和Hind Ⅲ 進(jìn)行雙酶切，并用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，使用卡那抗性平板篩選陽性克隆，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，Kpn I、Hind Ⅲ 進(jìn)行雙酶切鑒定，并由上海美吉生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)的陽性質(zhì)粒命名為：pET-30a（+）/AB。

1.6 AB融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒pET-30a（+）/AB轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那抗生素篩選后，挑取單菌落至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD600為0.4～0.6，加入IPTG（終濃度1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)，優(yōu)化誘導(dǎo)條件，選擇表達(dá)量最高的誘導(dǎo)條件并設(shè)置空pET-30a（+）載體對(duì)照，4℃、8341×g 離心菌液5 min，收集菌體。取2 mL菌液的菌體重懸后與5倍濃度上樣緩沖液混勻，100℃水浴10 min，進(jìn)行SDSPAGE電泳和Western blot檢測(cè)。擴(kuò)大培養(yǎng)陽性的AB重組菌并誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體后超聲破碎并凍融，12 511×g 離心10 min分別取上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE電泳，分析蛋白的可溶性。之后大量表達(dá)AB融合蛋白，參照分子克隆第三版使用包涵體蛋白的分離純化方法純化AB重組蛋白，利用兔源陽性血清以及His標(biāo)簽鼠單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行Western blot檢測(cè)，同時(shí)用蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定純化后AB蛋白濃度。

1.7 間接ELISA檢測(cè)方法的建立 利用不同濃度AB融合蛋白和不同稀釋倍數(shù)血清的試驗(yàn)方陣，確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。首先用抗原包被液（0.05 mol/mL碳酸鹽緩沖液）將蛋白分別稀釋到0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5 μg/mL，100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜；用1%明膠溶液37℃封閉2 h，PBST洗滌2次；PBST將陽性血清和陰性血清分別按1:5、1:10、1:50、1:100、1:500、1:1000、1:2000稀釋，100 μL/孔加入酶標(biāo)板，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次；按100 μL/孔加入1:10 000稀釋的酶標(biāo)二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次；100 μL/孔加入TMB顯色液，37℃孵育15 min，最后50 μL/孔加入2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)。測(cè)定酶標(biāo)板在OD450下數(shù)值，選取P/N數(shù)值最大且陽性血清OD450值接近1.0所在孔為最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)[10]。之后摸索優(yōu)化封閉液封閉時(shí)間和溫度、血清反應(yīng)時(shí)間和濃度等實(shí)驗(yàn)條件，利用25份陰性血清OD450數(shù)值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)算血清陰陽性判斷臨界值。

1.8 特異性阻斷實(shí)驗(yàn) 陰性血清和陽性血清各1份，1:200到1:6400倍比稀釋，加入等量5 μg/mL的抗原液置于37℃作用2 h，同時(shí)設(shè)稀釋度相同但不加抗原的陽性血清作為對(duì)照，然后用實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA方法檢測(cè)。

1.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 抽取陰陽性血清各5份檢測(cè)并記錄OD450數(shù)值，之后每周在相同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)檢測(cè)6次，計(jì)算變異系數(shù)（CV），比較結(jié)果差異。

1.10 敏感性實(shí)驗(yàn) 將4份陽性血清經(jīng)1:20、1:80、1:3200、1:12 800、1:51 200、1: 204 800倍數(shù)稀釋，以優(yōu)化后的間接ELISA方法測(cè)定對(duì)血清的檢出極限。

1.11 AB融合蛋白與VP60蛋白作為不同包被抗原檢測(cè)臨床樣品實(shí)驗(yàn) 取免疫保護(hù)等實(shí)驗(yàn)獲得的待檢血清80份，分別以AB融合蛋白與完整VP60蛋白作為包被抗原進(jìn)行間接ELISA方法檢測(cè)，對(duì)比兩者效果異同。

2 結(jié)果

2.1 AB片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建 以pBL-RHDV為模板，通過融合PCR擴(kuò)增出AB基因，其長度為936 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。將AB片段使用Kpn I 和Hind III 雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的pET-30a(+)連接，獲得pET-30a(+)/AB重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳顯示936 bp處有目的條帶，且載體位置與空載體對(duì)照相符合（圖2）。陽性質(zhì)粒通過序列驗(yàn)證，表明成功構(gòu)建了含有AB抗原片段的重組表達(dá)質(zhì)粒。

圖1 AB基因的融合PCR產(chǎn)物Fig.1 Overlapping PCR products of AB gene

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)和Western blot分析 SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，AB融合蛋白加上pET-30a(+)上的His標(biāo)簽，表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為36 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符。同時(shí)，AB融合蛋白主要在重組菌體沉淀中，表明AB融合蛋白是以包涵體形式表達(dá)，使用包涵體蛋白的分離純化方法獲得純化的AB融合蛋白（圖3A）。用實(shí)驗(yàn)室前期制備的VP60多抗，以1:500倍稀釋為一抗對(duì)純化的AB融合蛋白進(jìn)行Western blot分析，可見純化后蛋白樣品在約36 kDa處出現(xiàn)反應(yīng)帶，表明融合蛋白具有良好的抗原性（圖3B）。

圖2 pET-30a(+)/AB重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物Fig.2 Identification of pET-30a(+)/AB by double digestion

圖3 SDS-PAGE(A)和Western-blot(B)分析結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE(A)and Western-blot (B)analysis of AB protein

2.3 確立間接ELISA最優(yōu)反應(yīng)條件 如表2所示，選取最佳抗原包被濃度為1 μg/mL，最佳血清稀釋倍數(shù)為1:500。之后優(yōu)化封閉液封閉時(shí)間和溫度、血清作用時(shí)間和溫度等實(shí)驗(yàn)條件，確定效果最佳的ELISA工作條件為1%明膠溶液37℃封閉2 h，待檢血清37℃孵育45 min，酶標(biāo)抗體1:15 000稀釋并在37℃作用45 min，底物在37℃作用15 min后終止反應(yīng)。根據(jù)25份陰性血清OD450值，計(jì)算臨界值： （平均值）+3×s（標(biāo)準(zhǔn)方差）=0.350，即當(dāng)待檢血清P/N＞2.1且OD450值＞0.350，即可初步判定檢測(cè)血清為陽性。

表2 最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)方陣分析Table 2 Analysis of the best antigen concentration and sera samples optimal dilutions

2.4 阻斷實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，用抗原處理過的陰性血清和陽性血清的P/N值均小于2.1，同時(shí)對(duì)照組陽性血清P/N值均大于2.1，證明表達(dá)的AB融合蛋白與血清中抗體的結(jié)合是特異的，該方法具有較好的特異性。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 重復(fù)檢測(cè)結(jié)果顯示（表3），10份血清各次的OD450值差異很小，計(jì)算平均值和方差，結(jié)果表明變異系數(shù)均在5%以內(nèi)，證明該方法重復(fù)性良好。

表3 間接ELISA重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability results of indirect ELISA

2.6 敏感性實(shí)驗(yàn) 將陽性血清按1:20到1:204 800倍數(shù)稀釋，當(dāng)陽性血清1:12 800稀釋時(shí)，檢測(cè)結(jié)果仍為陽性，顯示本研究建立的間接ELISA方法具有良好的敏感性。

2.7 AB融合蛋白與VP60完整蛋白分別作為包被抗原檢測(cè)臨床樣品 分別使用AB融合蛋白與VP60完整蛋白作為包被抗原，對(duì)80份待檢血清的陽性檢出率分別為72.5%和70.0%，只有兩份血清結(jié)果不符，且兩份血清P/N值均接近2.1，屬于弱陽性血清，表明兩種蛋白均可作為ELISA檢測(cè)方法的候選包被抗原。但在同樣的陰性血清和陽性血清對(duì)照中，完整VP60蛋白包被組檢測(cè)到的OD450數(shù)值偏高，且在檢測(cè)樣品中其檢出的P/N值普遍較小，說明VP60蛋白的AB優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)有更優(yōu)越的特異性，更適合用于建立ELISA檢測(cè)方法。

3 討論

目前國內(nèi)主要通過血凝抑制試驗(yàn)來進(jìn)行RHDV抗體檢測(cè)，但是該方法中人血紅細(xì)胞獲取不易，血清需要吸附處理[11]，血凝抑制實(shí)驗(yàn)本身亦存在主觀性強(qiáng)、檢測(cè)效率低、重復(fù)性差等缺點(diǎn)。而以兔出血癥病毒作為包被抗原的ELISA檢測(cè)方法，仍存在大量技術(shù)和工藝上的問題，例如沒有合適的可傳代細(xì)胞系，病毒培養(yǎng)和純化成本高，病毒純化不良導(dǎo)致非特異性反應(yīng)，存在生物安全問題等[12]；另外，由于使用肝組織制備RHDV全病毒滅活苗的原因，若基于全病毒建立ELISA檢測(cè)方法勢(shì)必會(huì)檢測(cè)到非中和性抗體，從而導(dǎo)致背景值偏高。這些因素在很大程度上限制了全病毒ELISA檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化與工業(yè)化。

研究結(jié)果證明RHDV的衣殼蛋白VP60是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是最主要的免疫保護(hù)性抗原[13]。1994年Laurent 等[14]通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了VP60蛋白，經(jīng)Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了表達(dá)產(chǎn)物的抗原性，緊接著Nagesh等[15]觀察到表達(dá)的VP60蛋白可以形成類病毒顆粒VLPs。中國秦海斌等[4]利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP60蛋白并建立了抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法。近年來還有報(bào)道利用昆蟲細(xì)胞中蛋白成分與哺乳動(dòng)物血清中抗體成分交叉反應(yīng)性小的特點(diǎn)，使昆蟲細(xì)胞系以可溶的形式表達(dá)VP60蛋白，可以不經(jīng)純化直接作為ELISA包被抗原，從而省卻抗原純化的成本[5]。但由于RHDV完整的衣殼蛋白分子量偏大，無論用原核表達(dá)系統(tǒng)還是真核表達(dá)系統(tǒng)都存在表達(dá)不穩(wěn)定和表達(dá)量偏低的缺陷，這些因素都增加了使用衣殼蛋白建立ELISA檢測(cè)方法的難度。

1998年，Torrecuadradan等[7]發(fā)現(xiàn)VP60有兩個(gè)主要抗原優(yōu)勢(shì)區(qū)域，分別位于VP60蛋白N端的第31位到第250位氨基酸之間和C端的第477位到第579位氨基酸之間，而且N端的抗原性顯著強(qiáng)于C端。Viaplana等[6]也從另一角度證實(shí)了此結(jié)論的正確性，他們將RHDV的衣殼蛋白VP60分成5個(gè)相互重疊的片段，分別在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，將重組蛋白分別與自然感染和人工免疫兔的RHDV抗血清進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示VP60蛋白氨基端（包括蛋白的前175個(gè)氨基酸）與抗血清的反應(yīng)最強(qiáng)，而蛋白羧基端則較弱。以上結(jié)果表明VP60主要的抗原決定區(qū)分別在其兩端，而中間區(qū)域的氨基酸序列對(duì)抗原性影響不大。

本研究將RHDV衣殼蛋白截短，分別將羧基端和氨基端的優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)融合在一起，此種構(gòu)建方式不僅有利于提高抗原的表達(dá)量，還增強(qiáng)了ELISA檢測(cè)的特異性和敏感度，在兔瘟疾病的防控上有重要的應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)優(yōu)化，AB融合蛋白經(jīng)表達(dá)純化后可得到濃度為5 mg/mL的目的蛋白，Western blot檢測(cè)目的蛋白具有很好的抗原性。建立的ELISA方法抗原包被濃度低，待檢血清孵育時(shí)間短。通過對(duì)該方法各項(xiàng)性能的評(píng)價(jià)，確定該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。這為生產(chǎn)兔瘟的快速診斷試劑盒提供了參考方向，對(duì)兔瘟的防制、疫苗免疫效果評(píng)價(jià)和抗體水平監(jiān)測(cè)等都具有深遠(yuǎn)意義。

[1]劉勝江, 薛華平, 浦伯清, 等. 兔的一種新病毒病—兔病毒性出血癥[J]. 畜牧與獸醫(yī), 1984, 16(6): 253-255.

[2]楊龍圣, 薛家賓, 王芳, 等. 兔出血癥發(fā)病概況及疫苗研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 256(2): 144-147.

[3]Wang X, Qiu L, Hao H, et al. Adenovirus-based oral vaccine for rabbit hemorrhagic disease[J].Vet Immunol Immunopathol, 2012, 145(1): 277-282.

[4]秦海斌. 兔出血癥病毒單克隆抗體的制備及抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立[D]. 陜西: 西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.

[5]劉懷然, 曲連東, 劉家森, 等. 昆蟲細(xì)胞表達(dá)兔出血癥VP60蛋白間接ELISA方法建立及評(píng)價(jià)[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 41(8): 81-88.

[6]Viaplana E, Plana J, Villaverde A. Antigenicity of VP60 structural protein of rabbit haemorrhagic disease virus [J].Arch Virol, 1997, 142(9): 1843-1848.

[7]Martinez-Torrecuadrada J L, Cortes E, Vela C, et al. Antigenic structure of the capsid protein of rabbit haemorrhagic disease virus [J]. J Gen Virol, 1998, 79(Pt8): 1901-1909.

[8]邱立, 郝華芳, 王興龍, 等. 兔病毒性出血癥病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J].畜牧與獸醫(yī), 2013, 45(1):29-33.

[9]Liu G Q, Ni Z, Yun T, et al. Rescued virus from infectious cDNA clone of rabbit hemorrhagic disease virus is adapted to RK13 cells line [J]. Chinese Sci Bull,2006, 51(14): 1698-1702.

[10]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem,1976, 72: 248-254.

[11]鞏薇, 衛(wèi)禮, 付瑞, 等. 兔出血癥病毒血凝試驗(yàn)及血凝抑制試驗(yàn)影響因素的探討[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理, 2003,20(3): 7-10.

[12]李超美, 王芳, 蔡少平, 等. 檢測(cè)兔出血癥病毒抗體間接ELISA方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 26(3): 546-550.

[13]Abrantes J, van der Loo W, Le Pendu J, et al. Rabbit haemorrhagic disease (RHD)and rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV): a review [J]. Vet Res, 2012, 43(1):12.

[14]Laurent S, Vautherot J F, Madelaine M F, et al.Recombinant rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus self-assembles into viruslike particles and induces protection [J]. J Virol,1994, 68(10): 6794-6798.

[15]Nagesha H S, Wang L F, Hyatt A D, et al. Selfassembly, antigenicity, and immunogenicity of the rabbit haemorrhagic disease virus (Czechoslovakian strain V-351)capsid protein expressed in baculovirus [J]. Arch Virol,1995, 140(6): 1095-1108.