吳曉剛，高旭元，余 磊，李雪松，閆麗萍，滕巧泱，李國(guó)新，李澤君

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）引起的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋下降為主要特征的傳染病。該病2010年春季在中國(guó)上海市、浙江省和江蘇省等地發(fā)生，繼而傳播到全國(guó)大多數(shù)養(yǎng)鴨地區(qū)[1,2]。病鴨主要表現(xiàn)為高熱、運(yùn)動(dòng)障礙、食欲下降甚至廢絕，產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋下降甚至停止，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，死亡率可達(dá) 5%～10%[1,2]。幾年來(lái)，鴨坦布蘇病毒病給我國(guó)養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚無(wú)商品化的疫苗用來(lái)預(yù)防鴨坦布蘇病毒病。

在鴨坦布蘇病毒病發(fā)生初期，我們分離到了1株鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010株）[2]。把該強(qiáng)毒株在雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblasts，CEFs）上連續(xù)傳代培養(yǎng)180代，獲得了一株鴨坦布蘇病毒弱毒株（FX2010-180P株），該弱毒株是一株安全性和免疫原性良好的疫苗候選毒株[3]，我們以該弱毒株為種毒進(jìn)行了鴨坦布蘇病毒病活疫苗的研制。本研究對(duì)低溫保存的鴨坦布蘇病毒病活疫苗（FX2010-180P株）的原始種子和基礎(chǔ)種子進(jìn)行了純凈性檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)，并對(duì)毒種的病毒含量以及免疫原性進(jìn)行了測(cè)定，為鴨坦布蘇病毒病活疫苗的毒種保存期限提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自 Gibco公司，用于細(xì)胞培養(yǎng)；羊抗鼠 IgG-HRP 購(gòu)自Sigma公司；TMB顯色液購(gòu)自武漢博士德公司；具有中和活性的抗鴨坦布蘇病毒E蛋白的單克隆抗體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室制備并保存，這些試劑用于阻斷ELISA。

1.2 毒種和細(xì)胞 鴨坦布蘇病毒病活疫苗（FX2010-180P）的原始種子批（批號(hào)為179P-20110505）、基礎(chǔ)種子批（批號(hào)分別為180P-20110507和180P-20110509）。DF-1細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室保存，用于病毒滴度測(cè)定及病毒分離。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用鴨由種蛋（無(wú)特定病原，品種為麻鴨，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所）孵化，并飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心養(yǎng)鴨專用房間里的隔離器中，飼養(yǎng)至21日齡時(shí)使用。

1.4 雞胚成纖維細(xì)胞（CEFs）的制備 取9～10日齡SPF雞胚，無(wú)菌取出胚胎，去頭、爪、翅及內(nèi)臟，PBS洗滌2次，剪碎后，再用PBS液洗滌2次，自然沉淀，棄上清；每個(gè)胚加1～3 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，37℃水浴中消化8～10 min，其間振蕩3～4次，自然沉淀，棄上清；加入含有5%小牛血清的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液5～10 mL，用吸管反復(fù)吹打2～3次，450×g離心10 min，棄上清，取沉淀；加入含有5%小牛血清的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液，4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，分裝細(xì)胞瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，供接種病毒用。

1.5 毒種的TCID50測(cè)定 用無(wú)菌PBS將被檢毒種按10倍比進(jìn)行系列稀釋，取10-4～10-7四個(gè)稀釋度，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上生長(zhǎng)至80%～90%的DF-1細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔0.1 mL；37℃作用1～2 h， PBS清洗3次后換入含有2%胎牛血清的DMEM，5%CO2、37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 d，觀察并記錄出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞孔，用Reed-Muench法計(jì)算病毒含量[4]。

1.6 病毒的傳代與培養(yǎng) 取批號(hào)為180P-20110507毒種1支，用無(wú)菌PBS進(jìn)行100倍稀釋后，以0.1 MOI的量接種生長(zhǎng)良好長(zhǎng)成單層的CEF，吸附1.5 h。加入2%維持液，5%CO2、37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，約80%細(xì)胞病變時(shí)，收獲病毒液，離心后取上清液，分裝。取一部分按照1.5方法測(cè)定病毒含量，其余部分置于－20℃保存待用。

1.7 細(xì)菌和支原體檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法檢驗(yàn)[5]。

1.8 外源病毒檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的相關(guān)方法進(jìn)行[5]。將100倍稀釋的毒種（病毒含量≥103.5TCID50）與等量的抗DTMUV單抗作用后，用于雞胚檢查法、細(xì)胞檢查法、禽淋巴白血病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒等檢驗(yàn)。

1.9 鑒別檢驗(yàn) 把毒種稀釋至102.0TCID50/0.05 mL，與等量抗鴨坦布蘇病毒特異性單抗（中和效價(jià)≥5）混合，置37℃中和1 h后，接種96孔細(xì)胞板上長(zhǎng)成單層DF-1細(xì)胞，0.1 mL/孔，接種10孔。37℃作用1 h后，加入0.1 mL含5%胎牛血清的培養(yǎng)液，在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)144 h，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）[4]。

1.10 病毒的免疫原性檢測(cè) 30只21日齡麻鴨，隨機(jī)分成3組，每組10只。第1～2組分別接種劑量為101.5TCID50和102.5TCID50的由毒種增殖的病毒，接種方式為腿部肌肉注射，第3組為對(duì)照組，接種等體積的PBS。疫苗免疫后d14，采血，分離血清用于檢測(cè)抗體。同時(shí)，每只鴨子肌肉注射103.5TCID50的鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒（FX2010株）。攻毒后每天觀察試驗(yàn)鴨的臨床表現(xiàn)，并在d4剖殺，觀察鴨的病理變化，并采集脾臟、肺臟、腎臟、腦組織，用于分離病毒。

1.11 抗體檢測(cè) 按照參考文獻(xiàn)[6]中的阻斷ELISA檢測(cè)鴨坦布蘇病毒特異性抗體。用純化的鴨坦布蘇病毒作為包被抗原，4℃過(guò)夜；PBST緩沖液洗滌3次后，用5%脫脂乳封閉，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次后，加入100 μL不同稀釋度的血清樣品，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次后，加入抗鴨坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次后，加入2000倍稀釋的羊抗鼠 IgG-HRP，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次后，每孔加入100 μL TMB顯色液，避光顯色10 min；每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取吸光度OD450值。按如下方法計(jì)算阻斷率，阻斷率（%）=（陰性對(duì)照的吸光度－待測(cè)樣品的吸光度）/陰性對(duì)照的吸光度×100%。阻斷率值≥18.4%，樣品判定為陽(yáng)性；阻斷率值≤12.6%時(shí)，樣品判定為陰性；阻斷率值介于二者之間時(shí)，判定為可疑，重新檢測(cè)阻斷率仍小于18.4%則判為陰性。判定為陽(yáng)性的血清樣品的最高稀釋倍數(shù)即為該血清樣品的抗體效價(jià)。

1.12 病毒分離 將采集的脾臟、肺臟、腎臟和腦等組織，每克組織加1 mL PBS，研磨后離心，取上清。每種組織上清液分別接種DF-1細(xì)胞，分離病毒。同時(shí)，取等體積的脾臟、肺臟、腎臟和腦組織上清液混合后，接種DF-1細(xì)胞，觀察6 d，出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 低溫保存的毒種病毒含量測(cè)定 種毒在保存16個(gè)月后，經(jīng)在DF-1細(xì)胞上進(jìn)行病毒滴定，確定批號(hào)為179P-20110505的3份毒種的病毒含量分別為105.5、105.0、105.5TCID50/0.1mL；批號(hào)為180P-20110507的3份毒種的病毒含量分別為105.5、105.0、105.5TCID50/0.1 mL；批號(hào)為180P-20110509的3份毒種的病毒含量分別為105.67TCID50、105.67、105.5TCID50/0.1mL。與初始毒價(jià)相比，種毒在保存16個(gè)月后，病毒滴度沒(méi)有明顯降低（表1）。

2.2 病毒的純凈性檢驗(yàn) 對(duì)每批次毒種進(jìn)行純凈性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示無(wú)細(xì)菌、支原體和外源病毒污染。

表1 鴨坦布蘇病毒病活疫苗（FX2010-180P）毒種病毒含量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of virus titration of virus seeds for production of duck Tembusu virus live vaccine (FX2010-180P)

2.3 鑒別檢驗(yàn) 每批毒種都可以被抗鴨坦布蘇病毒特異性單克隆抗體中和，無(wú)CPE出現(xiàn)。

2.4 種毒的免疫原性檢測(cè) 把基礎(chǔ)種子在CEF上增殖后，低劑量免疫SPF麻鴨

2.4.1 抗體水平 雛鴨免疫后d14，第1、2組，即101.5TCID50和102.5TCID50劑量病毒免疫組，所有免疫鴨血清全部轉(zhuǎn)陽(yáng)，平均抗體效價(jià)分別達(dá)到1:41±23和1:50±22，而對(duì)照組鴨全部為陰性。

2.4.2 攻毒試驗(yàn)

2.4.2.1 臨床癥狀 攻毒后，第1、2組免疫雛鴨在攻毒后飲食、糞便及精神狀態(tài)等均無(wú)異常表現(xiàn)，而對(duì)照組雛鴨表現(xiàn)采食量下降，可見(jiàn)綠色稀便。

2.4.2.2 病理變化 攻毒后d 4剖檢全部鴨，觀察病理變化。第1組免疫鴨有1只表現(xiàn)為脾臟輕微腫大，該鴨抗體效價(jià)為1:10，其余9只鴨與第2組鴨的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸等均無(wú)肉眼可見(jiàn)的病理變化。非免疫對(duì)照組鴨則全部表現(xiàn)為脾臟明顯腫大。

2.4.2.3 病毒分離 102.5TCID50病毒免疫組的雛鴨的脾臟、肺臟、腎臟和腦等組織均沒(méi)有分離到病毒；101.5TCID50疫苗免疫組中1只雛鴨的肺臟分離到了病毒；非免疫對(duì)照組鴨的脾臟、肺臟和腎臟都分離到了病毒，有7只雛鴨腦組織中分離到了病毒，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鴨坦布蘇病毒病活疫苗種毒接種鴨誘導(dǎo)的抗體水平及保護(hù)效力Table 2 The antibody titers and protection induced by the progeny of virus seeds for production of Duck Tembusu virus live vaccine in ducks

結(jié)果顯示，鴨坦布蘇病毒病活疫苗（FX2010-180P）毒種在保存16個(gè)月后，病毒含量沒(méi)有明顯下降，免疫原性良好，毒種增殖病毒以101.5TCID50劑量接種仍然可以為90%的接種鴨提供保護(hù)。

3 討論

2010 年以來(lái)，鴨坦布蘇病毒病已給中國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，迫切需要安全性和免疫原性良好的疫苗來(lái)控制和預(yù)防該病的發(fā)生。黃病毒屬的病毒中，已經(jīng)報(bào)道了多株活疫苗，其中最為成功的是黃熱病弱毒疫苗株（17D株）[7]，該疫苗已有長(zhǎng)期的安全性和有效性記載，成為研發(fā)其他黃病毒弱毒疫苗的模型。另外，乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），西尼羅病毒（West Nile virus，WNV），登革熱病毒（Dengue virus，DENV）等病毒也已有多株活疫苗致弱毒株被報(bào)道[8-11]。對(duì)于黃病毒而言，將強(qiáng)毒株在培養(yǎng)介質(zhì)中連續(xù)傳代培養(yǎng)從而獲得弱毒疫苗株是一種實(shí)用并可行的方法。例如，黃熱病弱毒疫苗株（17D株）和乙型腦炎SA14-14-2 疫苗株即是通過(guò)強(qiáng)毒株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得的[12,13]。

本課題組將鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010株）在CEFs上連續(xù)傳代培養(yǎng)180代，獲得了安全性和免疫原性良好的弱毒株（FX2010-180P株），并進(jìn)行了鴨坦布蘇病毒病活疫苗的研制。為了檢驗(yàn)鴨坦布蘇病毒病活疫苗（FX2010-180P）的毒種在低溫條件下的保存期限，本研究抽取了3批次的毒種，分別檢測(cè)了各批次毒種的毒價(jià)及其中1批次毒種作為免疫原的免疫效力。鴨坦布蘇病毒病活疫苗（FX2010-180P株）種毒在-80℃保存16個(gè)月后，病毒含量沒(méi)有明顯降低，免疫原性良好，該毒種的保存期試驗(yàn)將繼續(xù)進(jìn)行。

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