羊傳染性膿皰病毒湖北分離株CBP二級結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞表位的預(yù)測

黎攝兒，趙苗苗，崔 成，黎滿香

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙410128；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070）

羊傳染性膿皰病俗稱羊口瘡（contagious ecthyma），是由羊傳染性膿皰病毒（Orf virus,ORFV）引起的以綿羊、山羊為主等多種動物的一種急性、高度接觸性皮膚傳染病，通過直接接觸也可使人感染該病毒。ORFV是痘病毒科、副痘病毒屬的代表性成員之一，具有高度的嗜上皮性，感染途徑主要是通過損傷的皮膚和黏膜。臨床以皮膚形成丘疹、水皰、膿皰和痂皮為特征，如口唇、舌、鼻、乳房以及尾根等部位[1]。該病傳染性較強，發(fā)病率高，但死亡率低，其中以羔羊等幼畜最為易感[2]。目前，羊傳染性膿瘡病呈世界性分布，給養(yǎng)羊業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失也是不容小覷的。ORFV在免疫學(xué)上具有特殊性：初次感染痊愈后它可以再次感染宿主[3]。研究發(fā)現(xiàn)，由該病毒編碼的幾種免疫調(diào)節(jié)因子可抑制機體的免疫反應(yīng)從而使宿主發(fā)生再感染，羊傳染性膿皰病毒編碼產(chǎn)生的IL-10、IFNR、VEGF、GIF和CBP等毒力因子和細(xì)胞因子主要通過干擾宿主的免疫反應(yīng)，引起宿主發(fā)病，在宿主感染該病毒的致病機制中發(fā)揮重要作用[4]。CBP為ORF112的編碼產(chǎn)物，在病毒復(fù)制的早期表達(dá)，能夠較強地結(jié)合和抑制趨化因子，阻止趨化因子與相應(yīng)受體相互作用。

為進(jìn)一步弄清ORFV在宿主體內(nèi)的感染過程，并能更好的預(yù)防該病的發(fā)生。本研究以O(shè)RFV湖北分離株毒力因子趨化因子結(jié)合蛋白（chemokinebinding protein, CBP）為靶抗原，對該毒株的CBP基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，運用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)、信號肽、優(yōu)勢的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，了解ORFV CBP基因的分子特性以及其編碼蛋白的功能，以及其在宿主機內(nèi)如何發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 毒株和試劑 ORFV-HB病毒株分離自湖北省某羊場發(fā)病山羊，由本實驗室分離、保存。LA Taq DNA聚合酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、DNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 羊口瘡病毒DNA的提取 從增殖ORFV 的小牛腎（madin-darby bovine kideny, MDBK）細(xì)胞病毒液中提取該病毒的DNA。具體方法參照大連寶生物工程有限公司的DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 引物的設(shè)計、合成與CBP基因的擴增 根據(jù)GenBank中登錄的ORFV CBP基因序列設(shè)計并合成1對引物，上游引物P1：5'-tgcatagtggacctgcgcaagct-3'；下游引物P2：5'-acttccattgttgcggcgttg-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以O(shè)RFV DNA為模板，采用PCR方法擴增CBP全基因，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，51℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，將純化回收的PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序。使用DNAStar lasergene 7.1程序包的Editseq軟件提供的模塊將ORFV CBP基因的測序結(jié)果轉(zhuǎn)換為氨基酸序列。

1.4 ORFV CBP二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 用SOPMA[6]服務(wù)器預(yù)測ORFV CBP蛋白的二級結(jié)構(gòu)，蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站：http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html。

1.5 ORFV CBP信號肽預(yù)測 利用Signal P4.1 Server軟件的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（NN）[8]，對推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行信號肽預(yù)側(cè)。

1.6 ORFV CBPB細(xì)胞表位的預(yù)測 使用DNAStar lasergene 7.1程序包中的Protean軟件提供的模塊對ORFV CBP蛋白進(jìn)行多參數(shù)預(yù)測，用Kyte-Doolittle法預(yù)測蛋白的親水性；用Emini法預(yù)測蛋白的表面可及性；用Karplus-Eisenberg法預(yù)測蛋白的柔韌性；用Jameson-Wolf法預(yù)測蛋白的抗原指數(shù)以及二級結(jié)構(gòu)。通過對ORFV CBP蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性指數(shù)、柔韌性參數(shù)、抗原指數(shù)、表面可及性等參數(shù)分析，若抗原指數(shù)≥1. 031，親水性指數(shù)≥0，氨基酸的抗原表位可及性指數(shù)≥1，且其內(nèi)部或附近又具有柔韌性結(jié)構(gòu)，氨基酸個數(shù)≥7，則這一區(qū)段為抗原表位的可能性較大。將ORFV CBP蛋白單參數(shù)預(yù)測結(jié)果結(jié)合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方案進(jìn)行綜合分析。最后將單參數(shù)預(yù)測綜合分析結(jié)果采用ABCpred[9]方案進(jìn)行篩選，并進(jìn)行驗證和評分，確定B細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位。

1.7 ORFV CBPT細(xì)胞表位的預(yù)測 應(yīng)用在線生物信息學(xué)網(wǎng)站，分析ORFV CBP T細(xì)胞表位。所用生物信息學(xué)網(wǎng)站有：細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTL）表位預(yù)測網(wǎng)站：http://www.imtech.res.in/raghava/ctlpred/；輔助T 細(xì)胞（Th）抗原表位的預(yù)測網(wǎng)站：http://www.imtech.res.in/raghava/propred/。

2 結(jié)果

2.1 ORFV CBP基因的PCR擴增及測序 以增殖ORFV的MDBK細(xì)胞上清中提取的該病毒DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，得到一條約843 bp的特異片段，與預(yù)期目的片段大小相符（圖1）。

圖1 MDBK細(xì)胞上清中的ORFV的CBP基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of CBP gene from cell cultures of MDBK cell

PCR產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定，確認(rèn)為ORFV CBP基因。使用DNAStarlasergene 7.1程序包的Editseq軟件提供的模塊將ORFV CBP基因的測序結(jié)果轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)ORFV CBP蛋白全長共281個氨基酸，序列見圖2：

圖2 ORFV CBP氨基酸序列Fig.2 ORFV CBP amino acid sequence

2.2 ORFV CBP蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 用SOPMA[6]服務(wù)器預(yù)測ORFV CBP蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖3，ORFV CBP蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和β-片層4種類型：其中α-螺旋占24.64%、β-片層占22.14%、β-轉(zhuǎn)角占3.39%、無規(guī)則卷曲占49.29%。整個二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋區(qū)域和無規(guī)則卷曲區(qū)域出現(xiàn)得較多，這有利于維持病毒膜蛋白的穩(wěn)定性。β 轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲是比較松散的柔性結(jié)構(gòu)，該區(qū)域常含有B細(xì)胞的優(yōu)勢表位[7]。CBP蛋白的無規(guī)則卷曲和β轉(zhuǎn)角即功能區(qū)主要位于第15～25、35～38、52～63、69～78、83～84、86～88、96～102、111～117、124～133、139～141、158～214、220～224、241～245、250～255、266～269、275～280位氨基酸（圖3）。

圖3 ORFV CBP蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.3 Prediction of secondary structure of ORFV CBP protein

2.3 ORFV CBP信號肽的預(yù)測 在線軟件SignalP4.1的預(yù)測結(jié)果顯示ORFV CBP蛋白沒有信號肽（圖4）。

圖4 ORFV CBP蛋白信號肽的預(yù)測Fig.4 The signal peptide prediction of CBP protein

2.4 ORFV CBPB細(xì)胞表位的預(yù)測 DNAStar lasergene 7.1程序包中的Protean軟件提供的模塊對ORFV CBP蛋白進(jìn)行多參數(shù)預(yù)測，預(yù)測結(jié)果見圖5。通過對ORF2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水性指數(shù)、柔韌性參數(shù)、抗原指數(shù)、表面可及性等參數(shù)分析顯示，若抗原指數(shù)≥1.031，親水性指數(shù)≥0，氨基酸的抗原表位可及性指數(shù)≥1，且其內(nèi)部或附近又具有柔韌性結(jié)構(gòu)，氨基酸個數(shù)≥7，則這一區(qū)段為抗原表位的可能性較大。經(jīng)過篩選，有7個區(qū)段可作為B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。將ORFV CBP蛋白單參數(shù)預(yù)測結(jié)果結(jié)合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方案進(jìn)行綜合分析后發(fā)現(xiàn)，同時有3種或以上的參數(shù)預(yù)測結(jié)果顯示，表位肽段為19～30、35～42、72～89、131～143、158～175、188～199、203～212、240～247、250～264位氨基酸可能存在B細(xì)胞表位，見表1。最后將單參數(shù)預(yù)測綜合分析結(jié)果采用ABCpred方案（窗口長度16，閾值0.51）進(jìn)行篩選，并進(jìn)行驗證和評分，發(fā)現(xiàn)ORFV CBP蛋白的第33～48、64～79、128～133、196～211、252～267、80～95、17～32和163～178位等區(qū)段可能存在優(yōu)勢B細(xì)胞表位，見表2。

圖5 DNAStar軟件預(yù)測的ORFV CBP細(xì)胞表位Fig. 5 Prediction of B cell epitopes of CBP by DNAStar software

2.5 ORFV CBP T細(xì)胞表位的預(yù)測

2.5.1 ORFV CBP CTL表位的預(yù)測 將ORFV CBP蛋白氨基酸序列提交CTL表位預(yù)測網(wǎng)站，選擇基于人工神經(jīng)法預(yù)測出ORFV CBP蛋白的7段CTL表位，即CSTHQNEVY（33～41位）、YTPSNMCMM（58～66位）、YTSTATGDA（77～85位）、LTDENTDTT（188～196位）、NTDTTPTTT（192～200位）、CVTSVNLHF（223～231位）和CSLNLSPGY（272～280位），見表3。

表1 不同方法預(yù)測的ORFV CBP的B細(xì)胞表位的肽段位置Table 1 B cell epitopes of ORFV CBP predicted by various methods

表2 ABCpred方案預(yù)測初篩肽段的結(jié)果Table 2 The score of the peptides obtained by preliminary prediction with ABCpred program

表3 ORFV CBP CTL表位預(yù)測Table 3 Prediction for CTL epitopes of ORFV CBP

2.5.2 ORFV CBP蛋白Th表位的預(yù)測 在線程序?qū)RFV CBP蛋白Th表位進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測出DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301 三種不同類型（見表4）。綜合分析ORFV CBP的39段3類結(jié)合肽，有3段結(jié)合肽為3類結(jié)合肽等位基因所共有，即VVLLLVLLG（2～10位）、LVLLGALTN（6～14位）和FRLQMRVGV（43～51位），為ORFV CBP蛋白的Th表位。

表4 ORFV CBP蛋白Th表位的預(yù)測Table 4 Prediction for Th epitopes of ORFV CBP protein

3 討論

本試驗將ORFV湖北分離株的CBP基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行了研究分析。分析結(jié)果表明，ORFV CBP整個二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋區(qū)域和無規(guī)則卷曲區(qū)域出現(xiàn)得較多，這有利于維持病毒蛋白的穩(wěn)定性。Β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲是比較松散的柔性結(jié)構(gòu)，該區(qū)域常含有B細(xì)胞的優(yōu)勢表位。蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β折疊的化學(xué)鍵能較高，能較牢固地維持蛋白的高級結(jié)構(gòu)，但很難較好地與抗體嵌合，且經(jīng)常處于蛋白質(zhì)內(nèi)部，因而很少成為抗原表位。但是該蛋白具有較多的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)單元，這些結(jié)構(gòu)易于扭曲、盤旋并展示在蛋白表面，有利于抗體嵌合，常含有B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位[9,10]。

信號肽為分泌蛋白在通過膜時N 末端所含作為信號的氨基酸序列，常由15～25個氨基酸構(gòu)成，N端含少量的堿性氨基酸，主要含不攜帶電荷的疏水性氨基酸，在蛋白成熟后信號肽序列將被剪切、去掉。通過預(yù)測信號肽可以避免預(yù)測的表位落在信號肽區(qū)，預(yù)測結(jié)果顯示ORFV CBP蛋白沒有信號肽。

當(dāng)前疫苗學(xué)研制新型疫苗的一個研究熱點是通過分析病毒的基因組序列來預(yù)測病毒的所有抗原信息，然后篩選出合適的候選抗原，進(jìn)而研制出有效的疫苗，這種研制疫苗的方法策略稱為“反向疫苗學(xué)”[11]。目前，已有幾十種預(yù)測B細(xì)胞抗原表位的算法，其中親水性、可及性、柔韌性及抗原性方案的預(yù)測效果相對較好[12]?；谌斯ど窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)算法的ABCpred方案，預(yù)測準(zhǔn)確率最高可達(dá)65.9%[13]。為了減少單參數(shù)預(yù)測方案的局限性，提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，筆者綜合這些方法對ORFV CBP蛋白潛在的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了預(yù)測和分析，推測ORFV CBP蛋白最可能的B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位為33～48、64～79、128～133、196～211、252～267、80～95、17～32和163～178。

T 細(xì)胞表位由T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）識別，B細(xì)胞表位由B細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）識別。T細(xì)胞表位在細(xì)胞內(nèi)由主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）I或II分子識別并遞呈到細(xì)胞表面，然后分別被CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞的TCR識別和輔助性CD4+T細(xì)胞的TCR識別。被CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞的TCR識別的細(xì)胞表位稱為細(xì)胞毒T細(xì)胞（cytotoxic T leukocyge，CTL）表位，后者稱為輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）表位。表位疫苗的研究盡管近年來發(fā)展迅速，但其應(yīng)用仍面臨一些亟待解決的問題。其中一個問題是：表位研究的不均衡，尤其對于動物病毒。譬如口蹄疫病毒，此前過多的表位研究主要集中于B細(xì)胞表位和Th 細(xì)胞表位，而缺乏對CTL 細(xì)胞表位的研究，導(dǎo)致表位疫苗中表位的組成缺乏必要的CTL 表位。因此，本研究對CTL表位的研究彌補了上述缺陷，使ORFV表位疫苗的理論依據(jù)更完善[14]。本研究所測得的CTL表位為33～41、58～66、77～85、188～196、192～200、223～231和272～280。

本研究運用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)平臺和生物軟件分析了ORFV CBP蛋白的二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測了ORFV CBP蛋白的B細(xì)胞表位、CTL抗原表位、Th抗原表位，為宿主如何對抗病毒感染提供新思路，并為進(jìn)一步探究ORFV的致病機制、免疫研究及表位疫苗的研制提供了理論依據(jù)。

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