吳莎 華清泉 楊琨 肖伯奎 張志敏

阿司匹林類藥物的主要成分是水楊酸鈉，是臨床常用的解熱、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕類藥物，在心血管疾病的預(yù)防中起到重要作用[1]。該藥在治療疾病的同時，高劑量使用也會產(chǎn)生明顯的毒副作用，聽力下降、耳鳴及言語認(rèn)知能力的降低是水楊酸鈉耳毒性的三大主要癥狀[2]。多年來，學(xué)者們從聽覺系統(tǒng)的不同層面探討了水楊酸鈉耳毒性的機制，包括耳蝸(形態(tài)學(xué)改變、電生理學(xué)以及生化等方面的改變)、蝸神經(jīng)(聽神經(jīng)復(fù)合動作電位、單根耳蝸神經(jīng)纖維自發(fā)放電活動、耳蝸神經(jīng)電生理活動的平均譜等)以及耳蝸核、下丘和聽皮層的神經(jīng)元放電和神經(jīng)遞質(zhì)等方面的研究[3～9]，然而，至今水楊酸鈉耳毒性具體機制仍在探索中。

研究表明水楊酸鈉能夠改變聽覺中樞系統(tǒng)興奮性，聽覺中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的失衡與水楊酸鈉所致耳毒性作用關(guān)系密切[10]。下丘是中樞聽覺系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)之一，具有精密加工和處理復(fù)雜聽覺信息的功能。γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與其特異性受體結(jié)合產(chǎn)生抑制性突觸后電位，谷氨酸脫羧酶(GAD)是GABA生成的關(guān)鍵酶，在體內(nèi)催化興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)轉(zhuǎn)化生成GABA[11]，GAD67作為GAD的亞型之一，負(fù)責(zé)維持GABA基本水平[12]。為此，本研究擬觀察長期注射水楊酸鈉對大鼠下丘GAD67蛋白表達的影響，探討其在水楊酸鈉致耳鳴、聽力下降中的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及處理 選擇健康成年Wistar大鼠18只(由湖北省預(yù)防科學(xué)院動物實驗中心提供)，雌雄不限，體重200～300 g，耳廓反應(yīng)靈敏、無中耳感染、強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將實驗動物隨機分為水楊酸鈉組(6只)、生理鹽水組(6只)、對照組(6只)。將水楊酸鈉(Sigma公司，S2679)溶于生理鹽水中配成10%溶液，水楊酸鈉組實驗動物肌肉(后腿)注射水楊酸鈉175 mg/kg，2次/天，時間間隔8小時，連續(xù)注射28天[6,13]；生理鹽水組每天相同時間及部位注射等量生理鹽水，連續(xù)注射28天；對照組實驗動物不予處理。

1.2ABR檢測 造模結(jié)束后，三組大鼠采用美國TDT系統(tǒng)進行ABR檢測。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，保持肛溫37 ℃并置于隔聲屏蔽室內(nèi)進行檢測。選用短聲(click)作為刺激聲，單耳給聲刺激，耳機發(fā)聲窗距外耳道口1 cm，刺激速率為21次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，觀察時程為10 ms，疊加次數(shù)1 024次。記錄電極置于兩側(cè)外耳道口與顱正中線交叉處皮下，參考電極置于同側(cè)耳乳突皮下，接地電極置于鼻尖正中皮下。測試聲響從110 dB SPL開始，以5 dB SPL逐次遞減，以波Ⅲ最后消失的上一強度作為ABR反應(yīng)閾，記錄ABR反應(yīng)閾及90 dB SPL時波Ⅲ潛伏期。

1.3Western blot檢測下丘GAD67蛋白表達 ABR檢測后將三組大鼠斷頭處死并在冰盤中迅速剝離下丘，-80 ℃冰箱保存。各組標(biāo)本分別加入適當(dāng)體積組織裂解液后冰上徹底勻漿，離心后取上清液。采用Bradford方法測定蛋白濃度，各組取總蛋白40 μg經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉1小時，將PVDF膜浸泡于兔抗鼠GAD67多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗滌5 min×3次，加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫下孵育30分鐘，TBST洗滌5 min×3次，在暗室內(nèi)加入ECL化學(xué)發(fā)光底物曝光，最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。選用β-action作為內(nèi)參照，并用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，比較各組下丘GAD67蛋白與β-action光密度比值。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組動物ABR檢測結(jié)果 水楊酸鈉肌肉注射28天后，水楊酸鈉組ABR波形分化較差，各波振幅下降。水楊酸鈉組、生理鹽水組、對照組ABR反應(yīng)閾及波Ⅲ潛伏期見表1，可見，水楊酸鈉組ABR反應(yīng)閾較生理鹽水組、對照組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；水楊酸鈉組波Ⅲ潛伏期較生理鹽水組、對照組明顯延長，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；生理鹽水組ABR反應(yīng)閾、波Ⅲ潛伏期與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組動物下丘GAD67蛋白表達結(jié)果 Western

表1 三組大鼠ABR反應(yīng)閾及波Ⅲ潛伏期比較

注：*與生理鹽水組、對照組比較，P<0.01

blot檢測結(jié)果顯示，實驗各組均表達相對分子量約為67 kDa的GAD67蛋白。與生理鹽水組、對照組比較，水楊酸鈉組下丘GAD67蛋白表達升高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)性意義(P<0.01)，而生理鹽水組與對照組下丘GAD67蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1，表2)。

圖1 Western blot檢測下丘GAD67表達

表2 三組大鼠下丘GAD67蛋白與β-action的光密度比值

注：與生理鹽水組、對照組比較，P<0.01

3 討論

阿司匹林廣泛應(yīng)用于臨床，至今約有150年的歷史。研究發(fā)現(xiàn)大劑量服用此類藥物(血藥濃度超過30 mg/dl)后，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)聽力下降及耳鳴[14]。同樣，動物研究顯示長期注射水楊酸鈉可致實驗動物ABR各波振幅下降、反應(yīng)閾升高且潛伏期延長[15]。本研究結(jié)果顯示，水楊酸鈉組動物肌肉注射水楊酸鈉28天后ABR反應(yīng)閾較生理鹽水組、對照組明顯升高，波Ⅲ潛伏期明顯延長；而生理鹽水組與對照組ABR反應(yīng)閾及波Ⅲ潛伏期無明顯差異，與上述報道一致，說明長期注射水楊酸鈉能夠?qū)е麓笫舐牴δ軗p傷。

在中樞聽覺系統(tǒng)中，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡是維持正常聽覺的重要因素，當(dāng)其平衡受到影響時勢必影響聽覺信號的正常輸入，導(dǎo)致聽覺障礙。GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在信號傳遞過程中起著重要的作用，可通過與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮抑制性效應(yīng)。研究指出水楊酸鈉可導(dǎo)致GABA發(fā)生下調(diào)使聽覺中樞抑制性效應(yīng)減弱，興奮性效應(yīng)增加，從而導(dǎo)致中樞聽覺系統(tǒng)神經(jīng)活動增強[16]而發(fā)生耳鳴。GAD是GABA合成的重要限速酶，在體內(nèi)催化谷氨酸(Glu)轉(zhuǎn)化為GABA，并直接影響腦組織中GABA的濃度，其在哺乳動物大腦中存在分子量分別為65 kDa、67 kDa兩種亞型，即GAD65、GAD67[12]。GAD65可能作為一種惰性儲備，提供GABA生成的短期需求；而GAD67則可能為機體提供更為長程的生理調(diào)節(jié)[17]，GAD表達的上調(diào)被認(rèn)為是使GABA能神經(jīng)元抑制性功能增加而發(fā)生的代償性反應(yīng)[18]。Bauer等[19]在動物實驗(8 mg/ml，連續(xù)4月)中發(fā)現(xiàn)，長期口服水楊酸鈉后GAD蛋白在動物下丘中表達上調(diào)，而在非聽覺結(jié)構(gòu)中，GAD蛋白表達無明顯改變。本研究結(jié)果顯示，水楊酸鈉組動物下丘GAD67蛋白表達較生理鹽水組、對照組明顯升高，而生理鹽水組與對照組GAD67蛋白的表達無明顯差異，說明長期肌肉注射水楊酸鈉能夠?qū)е麓笫笙虑餑AD67蛋白表達水平升高。推測在長期肌肉注射水楊酸鈉的過程中，聽覺通路持續(xù)性興奮，機體通過上調(diào)GAD67蛋白表達，作為負(fù)反饋以代償去抑制(GABA所介導(dǎo)抑制作用的降低)所引起的興奮與抑制的失衡狀態(tài)，促進抑制性效應(yīng)的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究結(jié)果表明長期注射水楊酸鈉能夠引起大鼠聽力下降及下丘GAD67蛋白表達上調(diào)。GAD67蛋白表達水平的升高極有可能作為一種機體對水楊酸鈉引起耳毒性的一種抑制性代償反應(yīng)和調(diào)節(jié)機制，其調(diào)節(jié)的具體機制有待進一步研究。

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