高偉，趙平，任浩，戚中田

第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，上海市醫(yī)學(xué)生物防護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)為單負(fù)鏈RNA病毒，屬絲狀病毒科(Filoviridae)絲狀病毒屬(Filovirus)，首先在西非發(fā)現(xiàn)，因靠近埃博拉河而得名。埃博拉病毒屬于生物安全四級(jí)(biosafety level 4，BSL-4)病原體，引起的疾病為埃博拉出血熱或稱埃博拉病毒病(Ebola virus disease, EVD)，潛伏時(shí)間2～21 d，從發(fā)病到死亡一般4～9 d。感染致死率最高可達(dá)90%，遠(yuǎn)高于嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)10%的致死率[1]。目前既無(wú)預(yù)防疫苗，也無(wú)特效治療藥物。

2014年3月EVD在西非暴發(fā)，由于當(dāng)?shù)蒯t(yī)療條件滯后，不能及時(shí)、有效地進(jìn)行病毒感染的診斷，對(duì)患者處理不當(dāng)，導(dǎo)致EVD呈播散傳播。隨著旅游業(yè)和相關(guān)貿(mào)易的發(fā)展，進(jìn)出疫區(qū)的機(jī)會(huì)增多，EVD傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步加大[2]。2014年7月中國(guó)香港地區(qū)報(bào)道1例疑似病例，引起全國(guó)關(guān)注，后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)病毒，因此早期診斷格外重要。本文就埃博拉病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行綜述。

1 埃博拉病毒

埃博拉病毒可分為扎伊爾埃博拉病毒(Zaire Ebola virus，ZEBOV)、本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo Ebola virus，BDBV)、雷斯頓埃博拉病毒(Reston Ebola virus，RESTV)、蘇丹埃博拉病毒(Sudan Ebola virus，SUDV)和塔伊森林埃博拉病毒(Ta? Forest Ebola virus，TAFV)(也稱科特迪瓦埃博拉病毒，Cote d’Ivoire Ebola virus)5個(gè)亞型，其中ZEBOV、BDBV和SUDV與非洲EVD大型疫情相關(guān)，本次疫情為ZEBOV所致。

埃博拉病毒在電鏡下呈多種形態(tài)，如“L”形、“U”形、“如意”形等[3]。病毒基因組長(zhǎng)度18.9 kb，基因排列順序是3′-NP-VP35-VP40-GP/sGP-VP30-VP24-L-5′，編碼7種病毒蛋白：核蛋白(nucleoprotein，NP)、聚合酶輔助因子(VP35)、基質(zhì)蛋白(VP40)、包膜刺突糖蛋白(glycoprotein，GP)、復(fù)制轉(zhuǎn)錄蛋白(VP30)、基質(zhì)蛋白(VP24)、RNA依賴性RNA聚合酶(L)(圖1)。埃博拉病毒核衣殼由單負(fù)鏈RNA基因組、NP、聚合酶L、VP35和VP30組成，GP在病毒顆粒表面形成完整的穗狀突起，基質(zhì)蛋白VP40和VP24將病毒核衣殼連接至病毒包膜[4]。GP通過(guò)受體結(jié)合介導(dǎo)病毒進(jìn)入易感細(xì)胞并在誘導(dǎo)中和抗體中起重要作用[5]。

圖1埃博拉病毒的基因組結(jié)構(gòu)示意圖

Fig.1DiagramofgenomicstructureofEbolavirus

2 實(shí)驗(yàn)室診斷方法

EVD的病原學(xué)診斷方法包括病毒學(xué)診斷與免疫學(xué)診斷。病毒學(xué)診斷又可分為病毒分離與培養(yǎng)、病毒核酸檢測(cè)，免疫學(xué)診斷主要包括抗原和抗體檢測(cè)。由于EVD患者一旦發(fā)病，其體液和血液具有高度感染性，故診斷需敏感、特異。為最大限度地降低誤診率，往往采取多種方法綜合診斷。目前常用方法見(jiàn)表1。

表1埃博拉病毒感染常用檢測(cè)技術(shù)

Tab.1DiagnosticassaysforEbolavirusinfection

檢測(cè)方法實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)靶點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)病毒分離病毒類(lèi)型的確定觀察細(xì)胞病變現(xiàn)象,檢測(cè)病毒核酸準(zhǔn)確檢測(cè)病毒類(lèi)型環(huán)境要求高,檢測(cè)周期長(zhǎng),無(wú)法批量檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)疫源地快速高效檢測(cè)基因組中的保守序列特異度高,速度快,高通量操作技術(shù)要求高,易出現(xiàn)假性結(jié)果抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或膠體金技術(shù)發(fā)病初期或死亡患者病毒蛋白(NP、GP等)特異度高,速度快,設(shè)備要求低取樣存在感染風(fēng)險(xiǎn)抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或膠體金技術(shù)愈后分析,流行病調(diào)查 人體產(chǎn)生的病毒抗體(IgG、IgM)特異度高,速度快,設(shè)備要求低患者早期未產(chǎn)生抗體前不能檢出

2.1 病毒分離

病毒分離是EVD診斷的可靠方法，特異度高。埃博拉病毒培養(yǎng)可選細(xì)胞株較多，目前最常用的是非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞和倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞，可通過(guò)觀察細(xì)胞病變、電鏡檢查或免疫學(xué)方法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行病毒學(xué)鑒定。培養(yǎng)時(shí)，將病毒樣本稀釋10倍，感染單層Vero細(xì)胞，2～3 d后可觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，待CPE達(dá)50%后用免疫熒光法檢測(cè)抗原[6]。一般在感染8 h后可在培養(yǎng)液中檢測(cè)到病毒RNA，7 d后可見(jiàn)Vero細(xì)胞變圓。通過(guò)病毒空斑實(shí)驗(yàn)，可計(jì)算出樣本中病毒滴度[7]。由于具有高致病性，故病毒的分離與培養(yǎng)要在BSL-4實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[2]。

2.2 病毒核酸檢測(cè)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)可通過(guò)檢測(cè)病毒核酸診斷EVD，靈敏度高，周期短。由于待檢標(biāo)本具有較高的傳染性，故行核酸檢測(cè)前標(biāo)本應(yīng)先經(jīng)過(guò)滅活。常用檢測(cè)埃博拉病毒核酸的擴(kuò)增引物見(jiàn)表2。常用檢測(cè)方法有套式反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，Q-PCR)[11-17]。在2000年烏干達(dá)暴發(fā)的EVD疫情中，科學(xué)家已研發(fā)出針對(duì)SUDV NP區(qū)的高致病性(Gulu)位點(diǎn)的套式RT-PCR特異性引物[12]。盡管RT-PCR法具有快速、靈敏、高效的特性，但存在假陽(yáng)性和假陰性，且不同實(shí)驗(yàn)室RT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度也有區(qū)別[19]。近年來(lái)，研發(fā)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。Drosten等應(yīng)用SRBY染料的一步法熒光定量RT-PCR中，設(shè)計(jì)的引物為Filo-A(5′-ATCGGAATT- TTTCTTTCTCATT-3′)和Filo-B(5′-ATGTGG-TGGGTTATAATAATCACTGACATG-3′)，用來(lái)特異性擴(kuò)增埃博拉病毒的L蛋白基因[11]。另外，基于TaqMan探針的Q-PCR也已應(yīng)用于EVD檢測(cè)。設(shè)計(jì)TaqMan探針，分別在5′端連接6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)和3′端連接淬滅熒光基團(tuán)[12]。已證明PCR是診斷EVD的特異、高效方法。

國(guó)內(nèi)也有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究。蓋微微等針對(duì)SUDV和ZEBOV的GP基因保守區(qū)序列，建立了基于TaqMan探針的實(shí)時(shí) PCR法，可用于對(duì)SUDV和ZEBOV分型，靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝[13]。Yang等還建立了可同時(shí)檢測(cè)馬爾堡病毒和埃博拉病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR[16]。我國(guó)目前已批準(zhǔn)5家公司的“埃博拉病毒核酸檢測(cè)試劑”，供在緊急情況下使用，其中一家公司的試劑可同時(shí)測(cè)出5個(gè)型別的埃博拉病毒。

表2已知檢測(cè)埃博拉病毒核酸的擴(kuò)增引物與探針

Tab.2PrimersandprobesusedinnucleicacidassaysforEbolavirus

引物或探針序列(5'-3')目的基因(bp)文獻(xiàn)RT-PCREBO-GP1 (F)AATGGGCTGAAAATTGCTACAATCEBOV GP (579)[8]EBO-GP2 (R)TTTTTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCACTRT-PCRRES-NP1 (F)GTATTTGGAAGGTCATGGATTCRESTV NP (337)[8]RES-NP2 (R)CAAGAAATTAGTCCTCATCAATCRT-PCRZAI-NP1 (F)GGACCGCCAAGGTAAAAAATGAZEBOV NP (268)[8]ZAI-NP2 (R)GCATATTGTTGGAGTTGCTTCTCAGCRT-PCREBO-SV (F)GATGAGGACAAACTTTTTAAEBOV NP,[9]EBO-SC (R)GCCTCACGCAGTTGCTGATATTGZEBOV NP (372)RT-PCRFATCGGAATTTTCTTTCTCATTGAAAGAZEBOV L (420)[10]RATGTGGTGGATTATAATAATCACTGA-CATGCATRT-PCRFilo-A (F)ATCGGAATTTTTCTTTCTCATTFilovirus L (419)[8, 11]Filo-B (R)ATGTGGTGGGTTATAATAATCACTG-ACATGNested SudZaiNP1(+)(F)GAGACAACGGAAGCTAATGCSUDV and ZEBOV NP[12]RT-PCRSudZaiNP1(-)(R)AACGGAAGATCACCATCATG (150)SudZaiNP2(+)(F)GGTCAGTTTCTATCCTTTGCSudZaiNP2(-)(R)CATGTGTCCAACTGATTGCC

(續(xù)表2)

F，上游引物；R，下游引物；P，TaqMan探針。

2.3 病毒抗原檢測(cè)

埃博拉病毒感染早期，患者組織和血液中的病毒滴度高，可通過(guò)檢測(cè)病毒蛋白進(jìn)行早期診斷。早期開(kāi)發(fā)了埃博拉病毒抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，1995年在剛果、1996年在加蓬和2000年在烏干達(dá)的EVD診斷中應(yīng)用[10,12,20]。目前，已開(kāi)發(fā)出用于檢測(cè)埃博拉病毒的抗原捕獲ELISA及膠體金檢測(cè)試劑盒，靶蛋白包括NP、VP40和GP等[21-24](表3)。

由于NP靶蛋白C端110位氨基酸具有很強(qiáng)的抗原性，因此所建立的用于抗原捕獲ELISA的單克隆抗體均位于該區(qū)域。對(duì)于不同病毒基因型，針對(duì)ZEBOV重組NP(recombinant NP，rNP)的單克隆抗體識(shí)別NP C端的構(gòu)象表位，而針對(duì)RESTV rNP的單克隆抗體識(shí)別的是線性表位[25]。有趣的是，抗原捕獲ELISA單克隆抗體中，識(shí)別RESTV的rNP(Res2-6C8 和 Res2-1D8)線性表位的單克隆抗體只能檢測(cè)RESTV rNP[21]，而捕獲ZEBOV rNP(3-3D)構(gòu)象表位的單克隆抗體可同時(shí)檢測(cè)ZEBOV、SUDV、RESTV和BDBV的rNP[21,23]。Lucht等制備了一組診斷ZEBOV rNP和RESTV rNP的單克隆抗體，可特異性結(jié)合ZEBOV NP、RESTV NP、SUDV NP[24]。此外，他們還研發(fā)了針對(duì)ZEBOV GP和VP40的ELISA試劑盒[24]。ZEBOV GP-ELISA只能檢測(cè)ZEBOV GP，而VP40-ELISA能檢測(cè)所有類(lèi)型埃博拉病毒的VP40[22]。

表3埃博拉病毒抗原檢測(cè)方法

Tab.3AntigendetectionforEbolavirus

靶蛋白捕獲抗體抗體識(shí)別位點(diǎn)檢測(cè)抗體病毒型扎伊爾蘇丹塔伊森林雷斯頓文獻(xiàn)EBOVZEBOV和SUDV混合單克隆抗體未指明ZEBOV和SUDV免疫兔血清RRUKR[20]RESTV NPRESTV NP單克隆抗體Res2-6C8RESTV NP C端RESTV rNP免疫兔血清NNNR[21]RESTV NP單克隆抗體Res2-1D8RESTV NP C端RESTV rNP免疫兔血清NNNR[21]ZEBOV VP40ZEBOV VP40單克隆抗體2C4未指明ZEBOV生物素標(biāo)記的單克隆抗體5F6RRRR[22]ZEBOV NPZEBOV單克隆抗體3-3DZEBOV NP C端ZEBOV rNP免疫兔血清RRPRR[23]ZEBOV GPZEBOV GP單克隆抗體3B11未指明ZEBOV過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體1G12RNNN[24]

R，陽(yáng)性反應(yīng)；UK，未知；N，不反應(yīng)；PR，可能反應(yīng)。

2.4 病毒抗體檢測(cè)

埃博拉病毒特異性IgM抗體在發(fā)病后2～9 d出現(xiàn)，持續(xù)存在至發(fā)病后1～6個(gè)月；IgG抗體在發(fā)病后6～18 d出現(xiàn)，持續(xù)存在至發(fā)病后2年以上。因此，IgG檢測(cè)診斷需用感染初期及其后的雙份血清，效價(jià)升高4倍或以上才有意義。由于EVD發(fā)病迅速，有的患者往往還沒(méi)有產(chǎn)生免疫應(yīng)答就已死亡，因此血清學(xué)診斷適用于流調(diào)溯源，而不適用于急性期診斷。基于病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒作為抗原開(kāi)發(fā)的間接免疫熒光法，已普遍應(yīng)用于埃博拉病毒的抗體檢測(cè)[26]。最近，基于埃博拉病毒抗原的IgG-ELISA和IgM-ELISA法已建立并成為埃博拉病毒感染的血清學(xué)診斷工具[27-29]。

為克服抗原來(lái)源的困難，幾個(gè)研究組建立埃博拉病毒重組蛋白的抗體診斷系統(tǒng)。Prehaud等首先報(bào)道了埃博拉病毒線性表位Gabon 94的rNP和rGP用于IgG和IgM抗體檢測(cè)[30]，同時(shí)比較了大腸埃希菌表達(dá)的埃博拉病毒rNP和桿狀病毒表達(dá)的埃博拉病毒rGP用作ELISA抗體檢測(cè)的功效[10]。7例EVD患者血清ELISA結(jié)果均為陽(yáng)性，而22例對(duì)照血清為陰性反應(yīng)[27]。Saijo等在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)一步表達(dá)了N端加入6個(gè)His標(biāo)簽的ZEBOV rNP，使ZEBOV rNP高效純化?；赯EBOV rNP的IgG-ELISA在ZEBOV、SUDV和RESTV的抗體檢測(cè)中均表現(xiàn)出高靈敏度和特異度[27]。應(yīng)用類(lèi)似方法，研究者開(kāi)發(fā)了基于ZEBOV rNP和RESTV rNP的IgG-ELISA系統(tǒng)[31]。Groen等研發(fā)的IgG-ELISA試劑盒用rNP或rVP35作為抗原，發(fā)現(xiàn)用rNP抗原包被的IgG-ELISA可用于所有埃博拉病毒的檢測(cè)，而應(yīng)用rVP35抗原包被的IgG-ELISA只能應(yīng)用于ZEBOV的檢測(cè)。此外，在采集的動(dòng)物和人血清樣本(26個(gè)陽(yáng)性和500個(gè)陰性)中，發(fā)現(xiàn)ZEBOV rNP IgG-ELISA比rVP35 IgG-ELISA具有更高的靈敏度[32]。國(guó)內(nèi)蓋薇薇等以埃博拉病毒VP40基因原核表達(dá)產(chǎn)物為抗原，建立了檢測(cè)埃博拉出血熱抗體的間接ELISA[33]。間接免疫熒光技術(shù)是另一種新的埃博拉病毒抗體檢測(cè)方法，用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)感染HeLa細(xì)胞生產(chǎn)埃博拉病毒 rNP及RESTV rNP，這2種蛋白在埃博拉病毒抗體檢測(cè)中具有高的敏感度和特異度[26,34]。常用埃博拉病毒抗體檢測(cè)方法見(jiàn)表4。

表4埃博拉病毒抗體檢測(cè)方法

Tab.4AntibodydetectionforEbolavirus

方法抗原來(lái)源抗原重組蛋白的表達(dá)靈敏度(陽(yáng)性樣品/陽(yáng)性對(duì)照)特異度(陰性樣本/陰性對(duì)照)文獻(xiàn)ELISAZEBOV(加蓬94株)rNP大腸埃希菌9/922/22[30]rGP桿狀病毒9/922/22ZEBOVrNP桿狀病毒13/1450/51[27]截短rNP (361^739)大腸埃希菌13/1450/51rNP桿狀病毒24/26489/500[32]rVP35桿狀病毒12/26489/500[32]ZEBOVrVP40大腸埃希菌20/2010/10[33]RESTV截短rNP (360^739)大腸埃希菌10/1072/72[31]間接免疫RESTVrNP桿狀病毒16/1696/96[26] 熒光法ZEBOVrNP桿狀病毒14/1447/48[34]

3 結(jié)語(yǔ)

據(jù)世界衛(wèi)生組織2014年10月29日通報(bào)，幾內(nèi)亞、利比里亞、塞拉利昂、尼日利亞、剛果、馬里、塞內(nèi)加爾、西班牙和美國(guó)等國(guó)家有13 567人感染，4 951人死亡。盡管10月底幾內(nèi)亞和塞內(nèi)加爾傳來(lái)EVD疫情結(jié)束的好消息，但鑒于EVD的高度傳染性，全球仍嚴(yán)陣以待。

2014年8月，來(lái)自哈佛大學(xué)Broad研究院等多處的研究人員對(duì)超過(guò)99個(gè)埃博拉病毒基因組進(jìn)行了測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)2014年流行的埃博拉病毒存在超過(guò)300個(gè)基因突變，在傳播期間基因突變的速度加快，且部分基因突變可能影響PCR診斷試劑中的引物。因此，在疾病流行期間，應(yīng)及時(shí)對(duì)病毒基因組進(jìn)行分析，也有助于開(kāi)發(fā)有效的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法[35]。

綜上所述，盡管已建立基于核酸、抗原和抗體的不同檢測(cè)技術(shù)，但考慮到埃博拉病毒感染及變異特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室診斷方法和技術(shù)還應(yīng)不斷完善。

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