房樹玉，吳艷花，崔曉云，范東瀛，安靜

首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學系微生物學教研室，北京 100069

登革病毒(dengue virus)是登革熱(dengue fever，DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)/登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)的病原體，主要傳播媒介為埃及伊蚊和白紋伊蚊，人類和靈長類動物是登革病毒的自然宿主。自1780年美國費城首次報道登革熱流行以來，登革熱和登革出血熱在世界各地的流行暴發(fā)不斷被報道。我國登革熱的主要流行地區(qū)是廣東、云南、臺灣等地區(qū)，近年來其發(fā)病率呈顯著上升趨勢，流行范圍也不斷擴大。根據世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)報道，全球每年有5 000萬～1 億例登革熱患者，死亡2.5 萬例，其中90%發(fā)生在15歲以下兒童中，由此可見登革熱已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。

登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，為有包膜的單股正鏈RNA病毒?；蚪M長約11 kb，病毒RNA的5′端有一個Ⅰ型帽子結構，3′端不含多聚腺嘌呤(poly A)尾，其余核苷酸形成單一開放讀碼框架，編碼至少3種結構蛋白：衣殼蛋白(capsid protein，C蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)，以及7種非結構蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)[2]。 E蛋白是登革病毒中顆粒最大的結構蛋白和主要包膜糖蛋白，相對分子質量為51 000～60 000，含489～495個氨基酸，其中N端約80%為胞外結構域，C端約20%為疏水跨膜區(qū)[3]。E蛋白在病毒吸附、與宿主細胞膜融合及病毒組裝過程中具有重要作用[4]。它既有黃病毒亞群和登革病毒血清型特異的抗原表位，又有與中和抗體及血凝素抑制抗體反應的抗原決定簇，故在病毒的致病和免疫過程中起十分重要的作用[5,6]。因此，研究E蛋白的功能及其在疾病診斷和防治中的應用價值目前備受關注。本研究對登革病毒E蛋白的原核表達條件進行優(yōu)化，探索可溶性E蛋白表達量較高的表達條件；在此基礎上進一步純化蛋白，獲得濃度和純度較高的目的蛋白，再用其免疫小鼠可誘發(fā)較強的體液免疫應答，初步表明了其在診斷和預防登革病毒感染中的潛在價值，為進一步研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1病毒株、菌株和質粒登革病毒2型(TR1751株)分離自登革熱患者血清，重組pReceiver-E質粒為本實驗室構建，pGEX-6P-1為本實驗室保存，表達菌BL21(DE3)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.1.2主要試劑樹脂型質粒DNA小量提取試劑盒購自北京賽百盛基因技術有限公司，谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B親和層析柱購自GE Healthcare，EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制性內切酶購自Fermentas公司，聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜購自Millipore公司，低相對分子質量蛋白標準購自Fermentas公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)購自Genview公司，E蛋白的單克隆抗體購自北京華大蛋白質研發(fā)中心有限公司。

1.2 方法

1.2.1登革病毒2型E蛋白基因的擴增及重組質粒E/pGEX-6P-1的構建與鑒定以pReceiver-E重組質粒為模板，擴增目的基因E蛋白基因胞外區(qū)片段，用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，與同樣酶切的pGEX-6P-1連接，構建重組質粒E/pGEX-6P-1，通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)和測序進行鑒定。

1.2.2登革病毒2型E蛋白的表達將鑒定正確的重組質粒E/pGEX-6P-1及質粒pGEX-6P-1轉化至BL21感受態(tài)細胞，37 ℃恒溫孵育過夜。分別挑取單菌落在含終濃度為50 μg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，按1∶100接種至3 ml 新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至600 nm處的光密度(optical density，OD)值約0.6，加入IPTG(工作濃度為0.5 mmol/L)，分別在37 ℃(5 h)、30 ℃(5 h)、26 ℃(5 h)、20 ℃(15 h)和16 ℃(15 h)誘導表達，并設未誘導對照、空菌對照和空載體對照。然后離心收集菌液，同時每個溫度取2份等量菌液，一份用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，分析菌體中目的蛋白的表達總量；另一份超聲裂解后，離心取上清液，用SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性表達情況。冰浴超聲裂解的條件為：功率400 kW，工作時間5 s，間隔時間12 s，工作次數99次，循環(huán)3次。破碎后的菌體在4 ℃、16 000 r/min離心10 min。利用Image J 軟件分析電泳條帶灰度值，確定表達最佳條件。

1.2.3重組蛋白的純化將鑒定正確的重組菌液按1∶100轉接至4 L含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，20 ℃誘導15 h后離心收集菌體；用60 ml Tris緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、50 mmol/L NaCl) 重懸，洗1次，13 000 r/min離心收集菌體；再用60 ml裂解緩沖液懸起，置冰上用超聲破碎儀裂解細菌，破碎后的菌體在4 ℃、 16 000 r/min離心10 min。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(pH 7.3)平衡谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B親和層析柱。將上清液緩慢加入親和層析柱，用至少10倍柱體積的PBS沖洗未吸附的雜蛋白，用還原型谷胱甘肽溶液(10 mmol/L 還原型谷胱甘肽、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)洗脫，收集洗脫液即獲得純化的重組蛋白。測定蛋白濃度后，抽濾分裝，貯存于-80 ℃。

1.2.4蛋白免疫印跡法鑒定重組蛋白純化后的重組蛋白經12%分離膠SDS-PAGE后，一塊膠用于考馬斯亮藍染色，另一塊膠半干轉印于PVDF膜上。與5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)過夜后，加入1∶500稀釋的抗登革病毒2型E蛋白的單克隆抗體，37 ℃孵育1 h；用含吐溫20的PBS(PBST)洗膜3次，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)羊抗鼠IgG，于37 ℃孵育1 h；PBST充分洗膜3次，暗室曝光。同時設谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)作為對照(本實驗室制備)，以排除非特異性干擾。

1.2.5免疫小鼠并進行抗體效價測定將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成3組：實驗組、GST對照組和空白組，每組6只。實驗組注射純化的重組E蛋白，對照組注射GST，空白組注射等量生理鹽水。實驗組與GST對照組注射量均為每只小鼠100 μg/次(100 μl)，免疫途徑為腿部肌肉和雙側后腳掌注射各50 μl。分別于第1、14、28天進行免疫。第3次免疫后2周斷尾取血，離心取血清，測抗體效價。將純化E蛋白稀釋至50 μg/ml，每孔100 μl，包被96孔板，4 ℃過夜；次日PBST洗板，封閉；PBST洗板，血清以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800梯度稀釋，并加入96孔板,設置復孔、陽性對照和陰性對照，37 ℃孵育2 h；PBST洗板，加入1∶2 000 HRP標記羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h；洗板并顯色，加入終止液后置酶標儀中測OD490值。

2 結果

2.1 重組質粒E/pGEX-6P-1的構建與鑒定

以pReceiver-E重組質粒為模板，擴增目的基因E蛋白基因的胞外區(qū)片段，用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，并連接pGEX-6P-1，構建重組質粒E/pGEX-6P-1。通過PCR鑒定到1條約1 185 bp的條帶，與預期大小一致(圖1)。測序結果顯示，重組質粒的序列與預期的序列完全一致。

2.2 登革病毒2型E蛋白的表達

將鑒定正確的含有重組質粒E/pGEX-6P-1的BL21菌液分別在37 ℃(5 h)、30 ℃(5 h)、26 ℃(5 h)、20 ℃(15 h)和16 ℃(15 h)條件下表達，并設未誘導、空菌對照和空載體對照。然后取2份等量菌液，超聲裂解后，一份用SDS-PAGE分析菌體中目的蛋白的表達總量；另一份離心后取上清液，用SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性表達量。結果發(fā)現，除空菌對照和空載體對照外，其余各組在71 000左右均有特異表達條帶。 Image J 軟件分析發(fā)現，在20 ℃誘導15 h時灰度值最大，表明此條件下總目的蛋白表達量最高(圖2)。離心等量破碎后的菌體，對上清液進行SDS-PAGE和蛋白灰度分析，發(fā)現可溶性蛋白表達量最大的誘導條件仍是20 ℃誘導15 h(圖3)。

1 and 2, PCR products (recombinant E/pGEX-6P-1 as the template); M, DNA marker.

M, protein marker; 1, empty BL21 control; 2, empty plasmid pGEX-6P-1 control; 3, BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E without induction; 4, BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E after induction at 16 ℃ for 15 h; 5, BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E after induction at 20 ℃ for 15 h; 6, BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E after induction at 26 ℃ for 5 h; 7, BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E after induction at 30 ℃ for 5 h; 8, BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E after induction at 37 ℃ for 5 h.

圖2重組質粒E/pGEX-6P-1在BL21菌中表達的SDS-PAGE分析
Fig.2SDS-PAGEanalysisoftheexpressionofrecombinantplasmidE/pGEX-6P-1inBL21

M, protein marker; 1, supernatant of BL21; 2, supernatant of empty plasmid pGEX-6P-1 control; 3, supernatant of BL21 (DE3)/pGEX-6P-1-E without induction; 4, supernatant of BL21/pGEX-6P-1-E after induction at 16 ℃ for 15 h; 5, supernatant of BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E after induction at 20 ℃ for 15 h; 6, supernatant of BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E after induction at 26 ℃ for 5 h; 7, supernatant of BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E after induction at 30 ℃ for 5 h; 8, supernatant of BL21(DE3)/pGEX-6P-1-E after induction at 37 ℃ for 5 h.

2.3 登革病毒2型重組蛋白E的純化

將含正確表達質粒的菌液擴大培養(yǎng)至3L培養(yǎng)基中，大量表達后用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B親和層析柱純化。結果顯示，在71 000左右得到一條特異條帶，純度達99%以上(圖4)。

M, protein marker; 1 and 2, recombinant E protein after purification.

2.4 重組蛋白E的蛋白免疫印跡鑒定

純化后的重組蛋白經12%分離膠SDS-PAGE后，轉印于PVDF膜上。蛋白免疫印跡結果顯示，純化得到的E蛋白與登革病毒E蛋白抗體有特異印跡反應，GST對照組與抗體沒有非特異性結合(圖5)。

1, GST protein; 2, recombinant E protein.

2.5 免疫小鼠血清特異性抗體效價的測定

將純化的重組蛋白E免疫BALB/c小鼠，第3次免疫后2周取血清進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。結果顯示，抗體效價為1∶3 200，明顯高于GST和生理鹽水對照組，表明純化的重組蛋白E有較好的免疫原性。

3 討論

登革病毒表面的E蛋白是登革病毒顆粒中最大的結構蛋白和主要包膜糖蛋白，在病毒致病過程中發(fā)揮重要作用[3,7]。E蛋白上有與宿主細胞結合的位點及4個血清型的抗原決定簇[1,8]。其特異抗體可阻止病毒的吸附和感染。Reyes-del Valle等研究發(fā)現，用純化的登革病毒E蛋白預處理幼倉鼠腎(baby hamster kidney, BHK)細胞，可阻止病毒對細胞的吸附，是研制登革病毒疫苗的靶分子[7]。另外，E蛋白可作為一個重要成分用于病毒感染的快速診斷。因此，眾多學者通過表達E蛋白而進一步研究登革病毒的致病機制及其診斷試劑和疫苗。有關登革病毒E蛋白表達及純化的報道很多。Sugrue等利用pGEX-KG載體表達登革病毒1型E蛋白，發(fā)現E蛋白以包涵體的形式存在[9]；Mason等也發(fā)現E蛋白以包涵體形式存在，且難以復性[10]。San-Miguel等研究發(fā)現，低溫并延長誘導時間可增加重組蛋白在大腸埃希菌中的可溶性表達[11]；Vasina等也發(fā)現，將誘導溫度從37 ℃降至25 ℃，可增加原核表達系統(tǒng)中可溶性蛋白的量[12]；本團隊前期研究也曾發(fā)現目的蛋白主要以包涵體的形式存在。綜合以上文獻報道，本研究嘗試了在低溫延長誘導時間的方法，以增加可溶性蛋白的表達。在綜合考慮時間和溫度對目的蛋白可溶性表達的影響后，本研究設計了5個不同誘導條件。結果顯示，對于登革病毒2型E蛋白，20 ℃誘導15 h條件下菌體中目的蛋白表達量及可溶性蛋白表達量相對較高。由于E蛋白C端有約100個氨基酸構成的疏水跨膜區(qū)[3]，不利于可溶性蛋白表達，因此為提高目的蛋白E蛋白的表達效率，本研究去除了E 蛋白編碼序列C端約300 bp的跨膜區(qū)，并以GST融合蛋白表達載體pGEX-6P-1為載體構建重組質粒，實現了溫和的純化過程。這樣不但不影響蛋白的天然結構和功能，而且表達產物純化方便，純化蛋白的純度較高。本實驗利用純化的E蛋白免疫BALB/c小鼠，可誘導產生1∶3 200的特異性抗體，表明所表達的蛋白具有較好的免疫原性，可用于后續(xù)相關實驗研究。

本研究通過構建載體并優(yōu)化表達條件獲得了登革病毒E蛋白的高效可溶性表達，用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B親和層析柱純化可獲得純度較高的蛋白，ELISA結果顯示該蛋白具有良好的免疫活性，這為進一步研究登革病毒的致病機制及其診斷試劑和疫苗奠定了基礎。

[1] Guzman MG1, Halstead SB, Artsob H, Buchy P, Farrar J, Gubler DJ, Hunsperger E, Kroeger A, Margolis HS, Martínez E, Nathan MB, Pelegrino JL, Simmons C, Yoksan S, Peeling RW. Dengue: A continuing global threat [J]. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(12 Suppl): S7-S16.

[2] Perera R, Kuhn RJ. Structural proteomics of dengue virus [J]. Curr Opin Microbiol, 2008, 11(4): 369-377.

[3] Jaiswal S, Khanna N, Swaminathan S. High-level expression and one-step purification of recombinant dengue virus type 2 envelope domain Ⅲ protein in Escherichia coli [J]. Protein Expr Purif, 2004, 33(1): 80-91.

[4] Crill WD, Roehrig JT. Monoclonal antibodies that bind to domain Ⅲ of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells [J]. J Virol, 2001, 75(16): 7769-7773.

[5] Chin JF, Chu JJ, Ng ML. The envelope glycoprotein domain Ⅲ of dengue virus serotypes 1 and 2 inhibit virus entry [J]. Microbes Infect, 2007, 9(1): 1-6.

[6] Modis Y, Ogata S, Clements D, Harrison SC. A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(12): 6986-6991.

[7] Reyes-del Valle J, del Angel RM. Isolation of putative dengue virus receptor molecules by affinity chromatography using a recombinant E protein ligand [J]. J Virol Methods, 2004, 116(1): 95-102.

[8] Gromowski GD, Barrett ND, Barrett AD. Characterization of dengue virus complex-specific neutralizing epitopes on envelope protein domain Ⅲ of dengue 2 virus [J]. J Virol, 2008, 82(17): 8828-8837.

[9] Sugrue RJ, Cui T, Xu Q, Fu J, Chan YC. The production of recombinant dengue virus E protein using Escherichia coli and Pichia pastoris [J]. J Virol Methods, 1997, 69(1-2): 159-169.

[10] Mason PW, Zugel MU, Semproni AR, Fournier MJ, Mason TL. The antigenic structure of dengue type 1 virus envelope and NS1 proteins expressed in Escherichia coli [J]. J Gen Virol, 1990, 71 (Pt 9): 2107-2114.

[11] San-Miguel T, Pérez-Bermúdez P, Gavidia I. Production of soluble eukaryotic recombinant proteins in E. coli is favoured in early log-phase cultures induced at low temperature [J]. Springerplus, 2013, 2(1): 89.

[12] Vasina JA, Baneyx F. Expression of aggregation-prone recombinant proteins at low temperatures: a comparative study of the Escherichia coli cspA and tac promoter systems [J]. Protein Expr Purif, 1997, 9(2):211-218.