盛琳君，宋芹芹，盧明枝，宋娟，孫鵬，王寶棟，遲苗苗， 韓俊

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206

根據(jù)病毒顆粒的物理特性、RNA序列和基因組結(jié)構(gòu)的差異，小RNA病毒科成員主要分為6個屬，即腸道病毒屬、鼻病毒屬、心臟病毒屬、口瘡病毒屬、肝病毒屬和雙?？刹《緦?。小RNA病毒可引起脊髓灰質(zhì)炎、感冒、甲型肝炎、心肌炎、手足口病等多種病毒性疾病?？滤_奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)被認為是引起心肌炎和心肌擴張的最重要病毒。持續(xù)的CVB3感染可導(dǎo)致慢性心肌炎和擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)，還可引起肝炎、胰腺炎和無菌性腦炎。與其他腸道病毒相似，CVB3編碼的2個蛋白酶——2A和3C是其復(fù)制所必需的[1]。CVB3蛋白酶2A是一種半胱氨酸蛋白酶，被認為是CVB3誘導(dǎo)心肌損傷的重要機制之一[2]，但其確切機制尚不明確。

為探討CVB3通過編碼蛋白酶2A干擾細胞因子表達的機制，本研究構(gòu)建CVB3蛋白酶2A的真核表達載體，轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)CVB3蛋白酶2A可抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)二聚體的形成，且阻止NF-κB的核轉(zhuǎn)錄。因此，通過蛋白酶2A阻止感染細胞分泌細胞因子可能是CVB3抵抗宿主抗感染免疫的可能途徑之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞、質(zhì)粒及試劑293T和幼倉鼠腎(baby hamster kidney, BHK)細胞株由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒資源中心保藏。帶有Flag標簽的CVB3蛋白酶2A真核表達載體由本室構(gòu)建并保存。10%胎牛血清購自美國Gibco公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗購自英國Abcam公司，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、感受態(tài)細胞DH5α購自日本TaKaRa公司，T4連接酶購自美國NEB公司，轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP購自美國Roche公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)293T、BHK細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2pcDNA3.1-2A真核表達載體eIF4G1的切割鑒定將構(gòu)建的pcDNA3.1-2A真核表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞至6孔板，設(shè)pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染對照組與空細胞對照組。轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，裂解，以5%濃縮膠和10%分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。25 V轉(zhuǎn)膜30 min，1∶1 000稀釋eIF4G抗體，1∶5 000稀釋HRP標記抗兔IgG抗體，用增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色檢測。

1.2.3NF-κB基因啟動子熒光素酶報告基因熒光檢測BHK細胞傳代鋪板于96孔板，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-2A和NF-κB基因啟動子熒光素酶報告基因載體pGL3-NF-κB promotor-Luc 24、36 h后，用10 ng/ml腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)分別刺激30 min，按試劑盒說明書(Promega，美國)用多標記微孔板檢測儀(PerkinElmer，美國)檢測熒光素酶的活性。

1.2.4免疫熒光實驗將BHK細胞傳代鋪板至12孔板，實驗組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-2A 24 h后，用10 ng/ml TNF-α刺激細胞30 min，然后4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色10 min。取出細胞片，丙酮固定10 min。加入含0.2% Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(pH 7.4)，用含1%牛血清白蛋白的PBS 37 ℃封閉30～60 min。加入1∶500兔抗人NF-κB p65多克隆一抗，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。加入1∶2 000 Alexa Fluor 594標記的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min。參照上述步驟，用1∶500的Flag標簽單克隆一抗和1∶2 000 Alexa Fluor 488標記的抗鼠二抗檢測蛋白酶2A的表達。用甘油封片，激光共聚焦顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V1200，日本)鏡下觀察。以上實驗同時設(shè)置細胞對照和pcDNA3.1空載體對照。

1.2.5NF-κB二聚體的形成收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-2A的BHK細胞。PBS洗1次，加入40 μl裂解液(1% NP40、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)裂解細胞，提取蛋白，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測總蛋白量，確定加樣量一致。經(jīng)12%非變性PAGE分離，用1∶1 000稀釋的NF-κB p65抗體進行蛋白免疫印跡檢測。對NF-κB p65二聚體、單體進行灰度掃描，計算p65二聚體形成效率：二聚體灰度值/(二聚體灰度值+單體灰度值)。比較分析CVB3蛋白酶 2A對NF-κB p65二聚體形成的影響。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-2A表達載體的鑒定

為明確構(gòu)建的CVB3 pcDNA3.1-2A表達載體是否發(fā)揮蛋白酶功能，將質(zhì)粒經(jīng)雙酶切并測序正確后轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，用蛋白免疫印跡法檢測eIF4G1的變化。結(jié)果顯示，CVB3蛋白酶2A使真核起始因子eIF4G1被切割，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體對照和空細胞對照組中eIF4G1未發(fā)生變化(圖1)。結(jié)果表明，pcDNA3.1-2A表達載體可發(fā)揮蛋白酶2A的功能。

1, pcDNA3.1-2A; 2, pcDNA3.1; 3, control.

2.2 CVB3蛋白酶2A抑制NF-κB基因啟動子熒光素酶活性

為了解CVB3是否通過蛋白酶2A干擾NF-κB活性，將pcDNA3.1-2A與pGL3-NF-κB promotor-Luc共轉(zhuǎn)染BHK細胞，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體為對照。用10 ng/ml TNF-α處理30 min，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-2A 24 h和36 h后均抑制NF-κB p65啟動子熒光素酶報告基因表達(圖2)，2個時間點均具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 CVB3蛋白酶2A對NF-κB基因啟動子熒光素酶活性的影響Fig.2 Effect of CVB3 2A protease on luciferase activity from NF-κB promoter

2.3 CVB3蛋白酶2A抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移

2.3.1免疫熒光結(jié)果為了解CVB3蛋白酶2A抑制NF-κB p65啟動子熒光素酶報告基因表達的原因，將pcDNA3.1-2A轉(zhuǎn)染BHK細胞；轉(zhuǎn)染24 h后，用10 ng/ml TNF-α處理30 min。Flag抗體檢測發(fā)現(xiàn)帶有Flag標簽的蛋白酶2A表達于細胞質(zhì)中(圖3，綠色)。用NF-κB p65抗體檢測，發(fā)現(xiàn)大部分NF-κB p65表達于胞質(zhì)，很少出現(xiàn)在細胞核(圖3，紅色)。轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1和BHK細胞組雖經(jīng)TNF-α刺激，但NF-κB p65可表達于細胞質(zhì)和細胞核。

2.3.2蛋白免疫印跡結(jié)果為了解CVB3蛋白酶2A是否抑制細胞內(nèi)NF-κB的二聚體形成，將pcDNA3.1-2A轉(zhuǎn)染BHK細胞，24、36和48 h后用TNF-α刺激30 min，收集細胞，檢測NF-κB p65二聚體形成。經(jīng)灰度掃描，計算二聚體形成效率。結(jié)果顯示，pcDNA3.1(圖4 A，泳道1)轉(zhuǎn)染細胞的NF-κB p65二聚體形成效率約為70%(圖4 B)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-2A后，NF-κB p65的二聚體形成明顯下降(圖4，泳道2～4)，NF-κB p65二聚體的形成效率分別降至56%、61%和60%(圖4 B)，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體相比有統(tǒng)計學差異(P=0.003 1、0.004 7和0.003 9)。結(jié)果表明，CVB3蛋白酶 2A可抑制NF-κB p65的二聚體形成，從而干擾NF-κB的功能。

3 討論

小RNA病毒為20面體結(jié)構(gòu)，基因組為單正鏈RNA，能引起人和動物多種疾病。研究表明，在小RNA病毒感染后的2～3 h，病毒蛋白酶2A和3C關(guān)閉宿主防御系統(tǒng)，并促進其他有利于病毒的細胞反應(yīng)。與其他腸道病毒蛋白酶2A一樣，CVB3蛋白酶2A參與病毒多聚蛋白的合成，還能切割一系列的宿主細胞蛋白，如真核翻譯起始因子eIF4G1和polyA結(jié)合蛋白[3,4]。本研究構(gòu)建的載體也能很好地切割eIF4G1，但不切割polyA結(jié)合蛋白。因此，蛋白酶2A與病毒感染后宿主細胞翻譯途徑被抑制有關(guān)[5]，并參與病毒RNA復(fù)制[6]、病毒翻譯[7]和病毒RNA穩(wěn)定[8]。

NF-κB信號通路的激活既是機體抵抗病原侵入的重要基礎(chǔ)，又是病原造成機體損害的常見機制。為了解CVB3是否通過蛋白酶2A干擾NF-κB功能，將構(gòu)建的pcDNA3.1-2A轉(zhuǎn)染細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CVB3蛋白酶2A干擾細胞的NF-κB功能而影響報告基因表達(圖3)。

After BHK cells were transfected with pcDNA3.1-2A, NF-κB and 2A protease were detected by NF-κB p65 antibody and Flag tag antibody. NF-κB p65: Red; Flag tag: Green; DAPI: Blue.

NF-κB廣泛存在于真核細胞內(nèi)，由Rel蛋白家族成員以同源或異源二聚體形式組成。已發(fā)現(xiàn)的NF-κB家族成員有NF-κB 1(p50/p105)、NF-κB 2(p52/p100)、p65(RelA)、RelB和c-Rel。幾乎所有Rel/NF-κB蛋白都可形成同源二聚體或異源二聚體，進入細胞核，結(jié)合至下游靶點DNA上，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。最常見的二聚體是p50-RelA異源二聚體。NF-κB的蛋白亞基必須發(fā)生同源或異源的二聚化，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。因此，NF-κB二聚體形成和入核是NF-κB發(fā)揮功能的重要環(huán)節(jié)之一。

為進一步了解蛋白酶2A的干擾機制，將pcDNA3.1-2A轉(zhuǎn)染細胞，觀察NF-κB二聚體的形成和入核，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB p65二聚體形成降低，且不能轉(zhuǎn)位至細胞核。這些結(jié)果提示，CVB3感染后通過蛋白酶2A阻止NF-κB的功能轉(zhuǎn)位形式，從而抑制細胞因子反應(yīng)通路。病毒是一類能調(diào)節(jié)和干擾促炎癥反應(yīng)的具有最多樣和復(fù)雜分子機制的病原，其對細胞內(nèi)先天性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)發(fā)生在多個水平，包括胞質(zhì)與胞核間的物質(zhì)交換水平。在宿主細胞抵抗病原的過程中，核轉(zhuǎn)錄因子入核啟動先天性免疫和mRNA出核編碼細胞蛋白至關(guān)重要。TNF-α刺激能促進NF-κB從胞質(zhì)進入胞核。本研究表明CVB3通過蛋白酶2A多途徑干擾NF-κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。

A: NF-κB dimerization detected with p65 antibody by Western blotting. 1, BHK cells transfected with pcDNA3.1; 2-4, BHK cells transfected with pcDNA3.1-2A for 24, 36 and 48 h. B: Histogram of NF-κB dimerization detected with p65 antibody by Western blotting.

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