朱景玙，楊國勛，孟哲峰，徐建青，張曉燕

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； 2. 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032； 3. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 4.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是艾滋病——獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原體。至2011年底，全球約有3 400萬(3 140萬～3 590萬)HIV感染者，同年新發(fā)250萬例艾滋病患者(http://www.who.intghohiven)。艾滋病對全世界社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和穩(wěn)定造成巨大損失，且缺乏有效疫苗。因此，開發(fā)高效、安全和廉價(jià)的抗艾滋病藥物是挽救患者生命的關(guān)鍵舉措，也是艾滋病防治的當(dāng)務(wù)之急[1]。目前應(yīng)用于臨床的標(biāo)準(zhǔn)抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy，ART)至少應(yīng)用3種抗反轉(zhuǎn)錄病毒(antiretroviral，ARV)藥物(http://www.who.int)才能成功抑制HIV復(fù)制，但其長期使用的毒副作用及HIV-1耐藥株的出現(xiàn)帶來了新的難題和挑戰(zhàn)。中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的精粹，其作用機(jī)制及原理均異于傳統(tǒng)的抗病毒藥物，在巨大的藥物寶庫中極可能存在具有天然抗HIV活性的藥物或其成分。在傳染病領(lǐng)域，我國著名藥學(xué)家屠呦呦曾在中藥黃花蒿中發(fā)現(xiàn)能對抗瘧疾的青蒿素，這是中藥對傳染病學(xué)的重大貢獻(xiàn)之一。因此，探尋有抗HIV活性的中藥或其成分對艾滋病治療具有重要意義。

紅花錦雞兒是豆科錦雞兒屬的一種矮小灌木，在我國東北、華北及華東地區(qū)均有分布。據(jù)《中藥大辭典》記載，其有健脾強(qiáng)胃、活血、催乳、利尿、通經(jīng)的功效，可治療虛損勞熱、陰虛喘咳、淋濁白帶等癥[2]。

本課題組對紅花錦雞兒地上部分的乙醇提取物進(jìn)行了抗HIV活性篩選，發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯提取物顯示一定的生物學(xué)活性，最終從中分離到2個(gè)活性成分，并鑒定為一類茋類化合物二聚體，化學(xué)名scirpusin A和scirpusin B(圖1)，為天然茋類二聚體[2-5]。同為茋類化合物的dibalanocarpol和oligostilbene balanocarpol曾被報(bào)道具有微弱的抗HIV-1活性[6]。因此，本研究對scirpusin A和scirpusin B的抗HIV-1作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步探索。

圖1 Scirpusin A和scirpusin B的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of scirpusin A and scirpusin B

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑Scirpusin A和scirpusin B粉末由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院楊國勛博士提供，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后用完全培養(yǎng)基配制，濃度為5 mg/ml，-20 ℃儲(chǔ)存。噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT)粉末購自Sigma-Aldrich公司，用于細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)溶解成5 mg/ml的黃色透明溶液，避光4 ℃保存。溶細(xì)胞用DMSO購自Promega公司，常溫避光保存。

1.1.2細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞為TZM-bl、293T和MT-4細(xì)胞系。TZM-bl細(xì)胞屬HeLa細(xì)胞系，表面共表達(dá)HIV-1受體分子CD4及輔助受體分子CC趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR5)、CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4, CXCR4)，并攜帶熒光素酶表達(dá)基因，HIV-1感染細(xì)胞時(shí)Tat蛋白可激活熒光素酶表達(dá)。293T細(xì)胞用于包裝假病毒。MT-4細(xì)胞系為T細(xì)胞來源的工程細(xì)胞系，用于培養(yǎng)HIV-1 ⅢB實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株。這3種細(xì)胞系均由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)AIDS Research and Reference Reagent Program提供 (http://www.aidsreagent.org)，前兩者用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1%青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin，PS)的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。MT-4細(xì)胞用含10% FBS和1% PS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.1.3病毒本實(shí)驗(yàn)采用的病毒有HIV-1包膜假病毒、水皰性口炎病毒G蛋白(vesicular stomatitis virus G protein，VSV-G)包膜的假病毒(VSVG-HIV)和HIV-1 ⅢB實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株。3種HIV包膜假病毒SVPB16(B亞型，R5)、SVPC12(C亞型，R5)和SH1.81(CRF01_AE，R5)由編碼相應(yīng)包膜的表達(dá)質(zhì)粒(NIH提供)和編碼Env除外的HIV-1全基因組骨架質(zhì)粒(pSG3△env)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝而成。骨架質(zhì)粒pSG3△env是含有HIV-1全長基因組序列的質(zhì)粒，在env及第1個(gè)tat序列起始序列有移碼突變，因此不能表達(dá)Env[7]。VSVG-HIV由包膜質(zhì)粒pVSV-G(本室提供)與HIV骨架質(zhì)粒(pSG3△env)包裝而成[7,8]，這種病毒顆粒包膜是VSV-G，核心為HIV。由包膜質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒包裝而成的假病毒只能對細(xì)胞進(jìn)行一輪感染。

待293T細(xì)胞在6孔板中生長至融合率為50%～60%(處于對數(shù)生長期)時(shí)，將包膜質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒按摩爾比1∶1轉(zhuǎn)染。所用轉(zhuǎn)染試劑為Turbo，操作按說明書進(jìn)行[9]。轉(zhuǎn)染2 d后，收集含病毒顆粒的上清液。 將HIV-1 ⅢB實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株(B亞型，X4)在MT4細(xì)胞中擴(kuò)增培養(yǎng)4 d，收集，1 000g離心10 min去除細(xì)胞及碎片，再用Milli-Q 0.45 μm濾器過濾，獲得的病毒液分裝后凍存于-80 ℃。取同批次的病毒液進(jìn)行滴度測定，獲得半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infectious dose，TCID50)值，并記錄。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)MTT比色法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測。檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶使外源性MTT還原為難溶于水的紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)，并沉積在細(xì)胞中。DMSO可溶解甲瓚晶體，在酶標(biāo)儀570 nm處讀取光密度(optical density，OD)值，即對應(yīng)細(xì)胞的生長狀況。以培養(yǎng)基的OD值為本底予以扣除，以不加藥物的孔為陽性對照(100%存活率)，在0.05% N-9(本室提供)中生長的細(xì)胞為陰性對照(0%存活率)。每孔中依次加入藥物(scirpusin A和scirpusin B的起始濃度分別為42.55 μmol/L和41.15 μmol/L)、104個(gè)細(xì)胞，總體積200 μl。將藥物進(jìn)行3倍稀釋，每個(gè)濃度下3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)4 h后，加入10% MTT液；于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)3.5 h，棄上清液；加入溶細(xì)胞用DMSO，在570 nm處讀取OD值。細(xì)胞的存活率為各孔OD值與陽性對照OD值的比值。

1.2.2抗病毒作用體系本實(shí)驗(yàn)采用的抗病毒細(xì)胞體系為TZM-bl，普通藥物實(shí)驗(yàn)按下述操作進(jìn)行：每孔中依次加入藥物(scirpusin A和scirpusin B的起始濃度分別為43 μmol/L和42 μmol/L，依次進(jìn)行3倍稀釋，每個(gè)濃度下3個(gè)復(fù)孔)、100 TCID50病毒液、104個(gè)細(xì)胞，每孔總體積250 μl。無藥物、無病毒感染的細(xì)胞為藥物抑制陽性對照(100%抑制率)，無藥物、有病毒感染的細(xì)胞為藥物抑制陰性對照(0%抑制率)。探討藥物作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)操作如下：每孔依次加入100 TCID50的病毒液、104個(gè)細(xì)胞，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)加入藥物，保持藥物濃度一致，每孔總體積250 μl。以無藥物、有病毒感染的細(xì)胞為陽性對照(100%感染率)，只用培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為陰性對照(0%感染率)。培養(yǎng)48 h后，去除上清液，裂解細(xì)胞，用Luciferase雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒(Promega公司)測量細(xì)胞裂解物中熒光素酶的表達(dá)[7]，Victor 3 熒光光度計(jì)(PerkinElmer)讀取相對熒光值(relative luminescence unit，RLU)。最后用SPSS 13.0軟件計(jì)算每種化合物的半數(shù)抑制濃度(50% inhibition concentration，IC50)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以mean±SD表示，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 抗病毒濃度的scirpusin A和scirpusin B無細(xì)胞毒性

為排除干擾，在進(jìn)行細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置的藥物濃度與抗病毒作用的藥物濃度一致。MTT結(jié)果表明，scirpusin A和scirpusin B在所有抗病毒濃度下對細(xì)胞生長的影響與陽性對照無顯著性差異(P>0.05)(圖2)，提示后續(xù)實(shí)驗(yàn)中觀察到的藥物抗病毒作用不是由細(xì)胞毒性產(chǎn)生的。

2.2 Scirpusin A和scirpusin B能有效抑制HIV-1感染TZM-bl細(xì)胞，且具有劑量依賴效應(yīng)

Scirpusin A和scirpusin B對SVPB16、SVPC12、SH1.81及HIV-1 ⅢB實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株感染的TZM-bl細(xì)胞均顯示有效的抗病毒作用，并呈現(xiàn)典型的“S”形曲線(圖3)。Scirpusin A抑制各亞型假病毒的IC50范圍為 2.40～4.02 μmol/L, Scirpusin B為0.45～1.76 μmol/L(表1)。Scirpusin A和scirpusin B抑制HIV-1 ⅢB實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株的IC50分別為4.77 μmol/L和1.33 μmol/L，scirpusin B作用更強(qiáng)。與scirpusin A相比，scirpusin B分子中的間位氫原子被酚羥基取代，兩者微弱的差別提示了抗病毒作用的差異來自于對位酚羥基的鄰位基團(tuán)。

A: Scirpusin A. B: Scirpusin B.

A: SPVB16. B: SPVC12. C: SH1.81. D: HIV-1 ⅢB.

表1 Scirpusin A和scirpusin B抑制假病毒SPVB16、SPVC12、SH1.81及HIV-1 ⅢB實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株作用的IC50(μmol/L)Tab.1 IC50 values of scirpusin A and scirpusin B in inhibiting pseudoviruses SPVB16, SPVC12, SH1.81 and laboratory-adapted strain HIV-1 ⅢB (μmol/L)

2.3 Scirpusin A和scirpusin B能抑制VSVG-HIV假病毒感染

Scirpusin A和scirpusin B對VSVG-HIV假病毒感染TZM-bl細(xì)胞也有抑制效果(圖4)。Scirpusin B的保護(hù)效果高達(dá)85%，scirpusin A的保護(hù)效果近60%。VSV-G是廣泛嗜性的病毒包膜，這種包膜假病毒與 HIV 包膜假病毒的區(qū)別在于包膜蛋白，它是表達(dá)VSV-G包膜的假型HIV，在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中作為病毒進(jìn)入細(xì)胞的陽性對照。Scirpusin A和scirpusin B能對這種包膜病毒感染產(chǎn)生抑制作用，提示茋類化合物對HIV-1作用的靶點(diǎn)可能在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的生命環(huán)節(jié)。

圖4 Scirpusin A和scirpusin B能有效抑制VSV-G包膜假病毒Fig.4 Anti-VSV-G pseudovirus activity of scirpusin A and scirpusin B

2.4 Scirpusin A在病毒進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)揮抗病毒作用

為探討茋類化合物能否影響HIV進(jìn)入細(xì)胞后的生命環(huán)節(jié)，本課題組進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。病毒與細(xì)胞分別共孵育1、2、3、8 h后加入scirpusin A，觀察感染病毒后細(xì)胞狀況的改變。由圖5可見，在病毒感染細(xì)胞的同時(shí)加入scirpusin A，感染率與陰性對照相當(dāng)，表明scirpusin A可完全阻斷病毒感染。在病毒與細(xì)胞共孵育1、2、3、8 h后加入scirpusin A，感染率分別為6%、8%、18%和30%，相應(yīng)條件下scirpusin A的抑制率分別為94%、92%、82%和70%。在共孵育8 h后，scirpusin A依然有抑制活性，表明scirpusin A在病毒進(jìn)入細(xì)胞后也可發(fā)揮抑制作用。

圖5 病毒感染細(xì)胞后scirpusin A對SPVB16的抑制作用Fig.5 Potent activity of scirpusin A against SPVB16 infection at different time points after infection

3 討論

HIV-1感染是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題，給感染者及社會(huì)帶來了巨大損失。迄今為止，人們針對HIV感染和復(fù)制的各個(gè)環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)了多種藥物，分為6類：核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NRTI)、核苷酸類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nucleotide reverse transcriptase inhibitor，NtRTI)、非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor，PI)、細(xì)胞進(jìn)入抑制劑﹝融合抑制劑(fusion inhibitor，F(xiàn)I)和共受體抑制劑(co-receptor inhibitor，CRI)﹞、整合酶抑制劑(integrase inhibitor，INI)[10]。與此同時(shí)，研究者也致力于在天然產(chǎn)物中尋找具備抗HIV活性的藥物。Scirpusin A和scirpusin B為天然成分，早期研究發(fā)現(xiàn)其能在體外保護(hù)細(xì)胞不被HIV-1感染[2]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了scirpusin A和scirpusin B的抗HIV效應(yīng)，能在體外細(xì)胞模型中抑制HIV-1 假病毒和實(shí)驗(yàn)室毒株的感染，且對病毒的抑制活性呈典型的“S”形曲線(即劑量依賴效應(yīng))。

許多研究表明，一些藻類、植物、菌類提取物能在HIV-1感染細(xì)胞的融合過程中發(fā)揮作用[1,11,12]。有研究者推測scirpusin A和scirpusin B也可能在HIV-1感染的膜融合過程中發(fā)揮效應(yīng)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。但本研究顯示，茋類化合物不僅能抑制HIV包膜假病毒，還能抑制VSV-G包膜假病毒，特別是scirpusin B對VSV-G包膜假病毒的抑制作用高達(dá)85%以上。本研究還顯示，VSV-G包膜假病毒進(jìn)入細(xì)胞后，茋類化合物仍發(fā)揮抗病毒作用，提示該作用可能與病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在病毒與細(xì)胞共孵育1 h添加藥物，此時(shí)影響的是病毒吸附細(xì)胞的過程[13]，1 h后病毒完成吸附進(jìn)入細(xì)胞。本研究中，scirpusin A在病毒吸附細(xì)胞后1～2 h后仍發(fā)揮抗病毒作用，在吸附7 h后還有70%左右的抑制作用，表明scirpusin A能在病毒進(jìn)入細(xì)胞后的多個(gè)生命活動(dòng)中發(fā)揮作用，具體機(jī)制有待深入研究。

本研究中，scirpusin B的抗病毒優(yōu)勢較scirpusin A更明顯。Scirpusin B比scirpusin A分子中多了一個(gè)酚羥基，提示適當(dāng)增加分子中酚羥基的數(shù)量能提高抗病毒活性。這對進(jìn)一步改造及優(yōu)化該類化合物提供了重要線索，同時(shí)提示在此基礎(chǔ)上對某些基團(tuán)進(jìn)行修飾改造可能會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的活性。

[1] 夏承來. HIV-1進(jìn)入抑制劑的篩選和T-20作用機(jī)制的研究[D]. 南方醫(yī)科大學(xué),2010.

[2] 楊國勛，亓建斌，程科軍，胡昌奇. 紅花錦雞兒地上部分抗HIV化學(xué)成分的研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 42(2): 179-182.

[3] 康昆，時(shí)育紅，張鵬飛，李琳，胡昌奇，楊國勛. 荊三棱化學(xué)成分的研究(Ⅰ)(英文)[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008,20(4):639-640, 649.

[4] Yang GX, Zhou JT, Li YZ, Hu CQ. Anti-HIV bioactive stilbene dimers of Caragana rosea [J]. Planta Med, 2005, 71(6): 569-571.

[5] 楊國勛. 紅花錦雞兒抗HIV化學(xué)成分的研究[D]. 復(fù)旦大學(xué),2004.

[6] Dai JR, Hallock YF, Cardellina JH 2nd, Boyd MR.HIV-inhibitory and cytotoxic oligostilbenes from the leaves of Hopea malibato [J]. J Nat Prod,1998,61(3):351-353.

[7] 仇超，彭虹，黃相剛，任莉，潘翔，邵一鳴，徐建青. 攜帶綠色熒光蛋白基因的單輪感染活性HIV假病毒的建立及其活性檢測[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006, 26(5):394-398.

[8] Li L, Ben Y, Yuan S, Jiang S, Xu J, Zhang X. Efficacy, stability, and biosafety of sifuvirtide gel as a microbicide candidate against HIV-1 [J]. PLoS One,2012,7(5):e37381.

[9] Liu A, Yang Y, Liu L, Meng Z, Li L, Qiu C, Xu J, Zhang X.Differential compartmentalization of HIV-targeting immune cells in inner and outer foreskin tissue [J]. PLoS One,2014,9(1):e85176.

[10] De Clercq E. Anti-HIV drugs: 25 compounds approved within 25 years after the discovery of HIV [J]. Int J Antimicrob Agents,2009,33(4):307-320.

[11] 譚建軍，陳慰祖，王存新. 阻斷HIV-1進(jìn)入細(xì)胞的抑制劑研究[J]. 北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,30(3):364-368.

[12] 毛芹超. 天然來源化合物抗HIV的活性篩選和ADS-J1抑制HIV進(jìn)入的作用機(jī)制研究[D]. 南方醫(yī)科大學(xué),2010.

[13] 蔣巖,陳春英,裴麗健,張輝,魏文青,王桂杰,邵一鳴. 硫酸酯化箬葉多糖抗HIV-1機(jī)制的初步研究[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2000,14(1):56-59.