韋榮昌+韋樹(shù)根（等）

摘要：針對(duì)天門冬[Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.]成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)及其他次生代謝物質(zhì)的特點(diǎn)，采用改良CTAB法對(duì)其基因組總DNA進(jìn)行提取，并對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。結(jié)果表明，改良CTAB法可從天門冬成熟葉片中獲得純度高、完整性好的總DNA，其OD260 nm/OD280 nm為1.86，OD260 nm/OD230 nm為2.36，濃度為390 μg/mL，產(chǎn)率達(dá)11.7 μg/g，多糖、多酚和RNA雜質(zhì)被去除干凈，無(wú)降解現(xiàn)象，說(shuō)明該方法提取的天門冬基因組總DNA質(zhì)量較高。

關(guān)鍵詞：天門冬[Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.]；DNA提??；CTAB法

中圖分類號(hào)：R282；Q7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1678-03

A Method for Extracting High Quality DNA from Mature Leaves

of Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.

WEI Rong-chang1，2，WEI Shu-gen1，F(xiàn)U Jin-e1，KE Fang1，PAN Li-mei1，DONG Qing-song1，TANG Qi3

（1. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023，China；

2. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；3.Horticulture & Landscape College，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

Abstract：The mature leaves of Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr. are rich in polysaccharides， polyphenols， protein and other secondary metabolism compounds preventing DNA extraction. The genomic DNA of A. cochinchinensis （Lour.） Merr. was extracted by improved CTAB method and DNA quantity was checked. The results showed that the genomic DNA was pure and integral without polysaccharides， polyphenols， RNA and degradation. The value of OD260 nm/OD280 nm and OD260 nm/OD230 nm were 1.86 and 2.36， respectively. The concentration and yield of DNA was 390 μg/mL and 11.7 μg/g. It can be concluded that this method could be used for extracting DNA with high quality from A. cochinchinensis （Lour.） Merr.

Key words： Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.； DNA extraction； CTAB method

天門冬[Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.]為百合科（Liliaceae）天門冬屬（Asparagus Linn.）多年生攀援草本植物，又名天冬，以干燥塊根入藥。性寒，味甘、苦，含有甾體皂苷、多糖、氨基酸等多種活性成分，具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、清肺生津等功效[1]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)天門冬的研究主要集中在形態(tài)特征與生境習(xí)性[2]、藥材鑒別[3]、化學(xué)成分[4，5]、藥理與功效[6]、栽培技術(shù)[7，8]等方面，對(duì)其分子水平上的研究剛起步[9，10]，試驗(yàn)材料也僅限于幼嫩葉片，而天門冬成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)和其他次生代謝物質(zhì)，大大增加了DNA提取的難度。本研究對(duì)傳統(tǒng)CTAB法進(jìn)行改良，獲得了一種得率高、穩(wěn)定性好、實(shí)用性廣的天門冬成熟葉片基因組DNA提取方法，為開(kāi)展天門冬分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

天門冬新鮮葉片采自廣西藥用植物園科研基地，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所馬小軍研究員鑒定。對(duì)種質(zhì)資源圃中保存的17份天門冬種質(zhì)資源進(jìn)行收集，分別為百色野生大天冬、龍勝野生小天冬、陽(yáng)朔栽培天冬、恭城野生小天冬、恭城野生大天冬、凌云野生大天冬、凌云野生小天冬、靈山野生小天冬、寧明野生小天冬、金秀野生小天冬、融水野生小天冬、靖西野生小天冬、靖西野生大天冬、田林野生大天冬、玉林野生大天冬、玉林野生小天冬、環(huán)江野生羊齒天門冬。每份種質(zhì)選取生長(zhǎng)狀況良好的植株，采集30片健康成熟的葉片，用硅膠干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室中待用。

1.2 儀器與試劑

低溫冰箱；高壓滅菌鍋；電子天平；水浴鍋；微量移液器；微型高速離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；電泳槽和電泳儀（北京市六一儀器廠）；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Un-verbindlicher Verkaufspreis）。β-巰基乙醇；氯仿/異戊醇（24∶1）；3 mol/L NaAC（pH 5.2）；異丙醇；75%乙醇；無(wú)水乙醇；2×CTAB抽提液[100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA（pH 8.0），2%CTAB，1%PVP]；0.1 TE（pH 8.0）緩沖液[1.0 mmol/L Tris-Cl，0.1 mmol/L EDTA]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的提取

1）稱取成熟葉片（去主脈）1.0～2.0 g，置于研缽中，迅速用液氮將葉片組織研磨成細(xì)粉末狀，然后將粉末適量分裝于1.5 mL離心管中。

2 ）在各離心管中加入65 ℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液1 000 μL和β-巰基乙醇20 μL，輕彈混勻，使粉末充分濕潤(rùn)，置于65 ℃水浴鍋中溫浴15 min，其間上下倒置混勻數(shù)次。

3）12 000 r/min離心10 min，將上清液移至新的1.5 mL離心管中，棄沉淀。

4）在上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min，將離心后所得上清液轉(zhuǎn)移入另一新的1.5 mL離心管中。重復(fù)抽提1次。

5）在上清液中先后加入1/10體積的3 mol/L NaAC（pH 5.2）和等體積異丙醇（NaAC和異丙醇均需提前預(yù)冷），輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，白色絮狀沉淀出現(xiàn)后，放置于-20 ℃冰箱中冰浴1 h，沉淀DNA。

6 ） 12 000 r/min離心10 min，棄上清液，分別用75%乙醇、無(wú)水乙醇各洗滌沉淀1 次，倒扣于干凈濾紙上自然風(fēng)干5～10 min，視沉淀量的多少加入20～50 μL的0.1 TE（pH 8.0）緩沖液溶解，置于-20 ℃貯存。

1.3.2 DNA質(zhì)量檢測(cè)

1）DNA純度及產(chǎn)率測(cè)定：取5 μL DNA樣品，經(jīng)TE稀釋100倍后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其在230、260、280 nm波長(zhǎng)處的光吸收值。DNA的純度用OD260 nm/OD230 nm和OD260 nm/OD280 nm來(lái)表示，當(dāng)OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0，OD260 nm/OD230 nm>2.0時(shí)，DNA的純度較高。若OD260 nm/OD280 nm<1.8時(shí)，說(shuō)明DNA樣品中有蛋白質(zhì)污染；若OD260 nm/OD280 nm>2.0時(shí)，說(shuō)明有RNA污染；而當(dāng)OD260 nm/OD230 nm<2.0時(shí)，則表明DNA溶液中有鹽和小分子雜質(zhì)殘留。根據(jù)OD260nm=1.0時(shí)溶液濃度為50 μg/mL計(jì)算DNA質(zhì)量濃度和產(chǎn)率：

DNA質(zhì)量濃度（μg/mL）=OD260 nm×50 μg/mL×稀釋倍數(shù)

DNA產(chǎn)率（μg/g）=[DNA質(zhì)量濃度（μg/mL）×TE體積（mL）]/試驗(yàn)材料用量（g）

2）DNA分子完整性測(cè)定：取3 μL DNA溶液樣品，加適量溴酚藍(lán)染色，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳（電壓≤5 V/cm）1 h，電泳緩沖液為1×TAE，電泳50～60 min后，經(jīng)0.5 μg/mL溴化乙錠（EB）染色20～30 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察照相、記錄。

3）SCoT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)：用改良CTAB法制備的DNA作為模板，選用48號(hào)引物，其序列為5′-ACAATGGCTACCACTGGC-3′，進(jìn)行SCoT-PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系中含10×Buffer 2.5 μL（10 mmol/L），Mg2+1.5 μL（1.5 mmol/L），dNTPs 0.5 μL（4.0 mmol/L），引物0.25 μL（10 μmol/L），Taq DNA聚合酶0.3 μL（5 U/μL），模板DNA 1 μL（50 μg/mL）。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min，36個(gè)循環(huán)（95 ℃變性50 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min），72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物置于瓊脂糖凝膠中電泳，以Lambda DNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，EB染色后進(jìn)行紫外光檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 天門冬DNA純度及產(chǎn)率

經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，天門冬DNA樣品的OD260 nm/OD280 nm=1.86（0.078/0.042），OD260 nm/OD230 nm=2.36（0.078/0.033）， 說(shuō)明改良CTAB法提取的天門冬DNA純度較高，沒(méi)有多糖、多酚、蛋白質(zhì)、RNA、鹽和小分子雜質(zhì)污染。計(jì)算得到DNA質(zhì)量濃度為390 μg/mL，DNA產(chǎn)率為11.7 μg/g。

2.2 天門冬DNA分子完整性

將天門冬DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改良CTAB法提取的天門冬DNA電泳條帶明亮、清晰，無(wú)拖尾、彌散現(xiàn)象，說(shuō)明該方法提取的天門冬DNA分子完整性較好，無(wú)降解現(xiàn)象。圖1為天門冬總DNA電泳圖。

2.3 天門冬DNA SCoT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用改良后的CTAB法提取的天門冬DNA作為模板進(jìn)行SCoT-PCR擴(kuò)增。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2所示，所得SCoT-PCR擴(kuò)增條帶清晰，帶型豐富，無(wú)雜帶，可以用于天門冬種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

3 小結(jié)與討論

高質(zhì)量基因組DNA的提取是進(jìn)行分子標(biāo)記等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)[11]，天門冬成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)和次生代謝物質(zhì)等，在DNA提取過(guò)程中，此類物質(zhì)可與DNA共沉淀、形成膠狀難溶物或產(chǎn)生褐變，嚴(yán)重影響DNA的質(zhì)量[12，13]。而幼嫩新生組織中的多糖、多酚和次生代謝物質(zhì)較少，細(xì)胞易于破碎，DNA提取產(chǎn)率高。因此，應(yīng)選擇幼嫩、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料[14]。

通過(guò)一系列措施，有效控制了天門冬成熟葉片中多糖、多酚、蛋白質(zhì)和次生代謝物質(zhì)等對(duì)DNA提取的影響。首先，CTAB既能有效裂解植物的細(xì)胞壁，又能溶解細(xì)胞膜，可較好地去除多糖等雜質(zhì)；其次，高分子合成樹(shù)脂PVP作為一種酚的絡(luò)合物，同時(shí)含有親水基團(tuán)和親油基團(tuán)，易溶于極性的有機(jī)溶劑，可有效地去除酚類物質(zhì)[15]；而β-巰基乙醇的巰基能與酚類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)氧，從而避免其氧化成醌類[16]，但PVP和β-巰基乙醇單獨(dú)使用效果不好，只有將二者按一定比例配合使用效果才理想。

改良CTAB法提取植物基因組DNA過(guò)程中，通過(guò)氯仿-異戊醇抽提，除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抽提1次，尚有雜質(zhì)殘留，抽提3次，DNA產(chǎn)率降低，而抽提2次的DNA質(zhì)量較高，這與陸嘉惠等[17]的報(bào)道基本一致。

植物基因組DNA提取方法較多，但其原理基本相同，主要包括破碎細(xì)胞、裂解細(xì)胞或組織，以去詬劑溶解細(xì)胞膜，從而促使蛋白質(zhì)變性，再用氯仿-異戊醇等有機(jī)溶劑對(duì)DNA進(jìn)行抽提純化。由于核酸基本集中在細(xì)胞內(nèi)，所以研磨的質(zhì)量好壞是提取基因組DNA的關(guān)鍵，只有充分研磨，細(xì)胞才能破碎，核酸才得以釋放[18]。

本試驗(yàn)是在CTAB法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的，以傳統(tǒng)的CTAB法為對(duì)照，但是由于成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)和其他次生代謝物質(zhì)，傳統(tǒng)的CTAB法無(wú)法提取天門冬的DNA，電泳結(jié)果為空白，故本試驗(yàn)只對(duì)改良CTAB法進(jìn)行分析和PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

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改良CTAB法提取植物基因組DNA過(guò)程中，通過(guò)氯仿-異戊醇抽提，除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抽提1次，尚有雜質(zhì)殘留，抽提3次，DNA產(chǎn)率降低，而抽提2次的DNA質(zhì)量較高，這與陸嘉惠等[17]的報(bào)道基本一致。

植物基因組DNA提取方法較多，但其原理基本相同，主要包括破碎細(xì)胞、裂解細(xì)胞或組織，以去詬劑溶解細(xì)胞膜，從而促使蛋白質(zhì)變性，再用氯仿-異戊醇等有機(jī)溶劑對(duì)DNA進(jìn)行抽提純化。由于核酸基本集中在細(xì)胞內(nèi)，所以研磨的質(zhì)量好壞是提取基因組DNA的關(guān)鍵，只有充分研磨，細(xì)胞才能破碎，核酸才得以釋放[18]。

本試驗(yàn)是在CTAB法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的，以傳統(tǒng)的CTAB法為對(duì)照，但是由于成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)和其他次生代謝物質(zhì)，傳統(tǒng)的CTAB法無(wú)法提取天門冬的DNA，電泳結(jié)果為空白，故本試驗(yàn)只對(duì)改良CTAB法進(jìn)行分析和PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

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改良CTAB法提取植物基因組DNA過(guò)程中，通過(guò)氯仿-異戊醇抽提，除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抽提1次，尚有雜質(zhì)殘留，抽提3次，DNA產(chǎn)率降低，而抽提2次的DNA質(zhì)量較高，這與陸嘉惠等[17]的報(bào)道基本一致。

植物基因組DNA提取方法較多，但其原理基本相同，主要包括破碎細(xì)胞、裂解細(xì)胞或組織，以去詬劑溶解細(xì)胞膜，從而促使蛋白質(zhì)變性，再用氯仿-異戊醇等有機(jī)溶劑對(duì)DNA進(jìn)行抽提純化。由于核酸基本集中在細(xì)胞內(nèi)，所以研磨的質(zhì)量好壞是提取基因組DNA的關(guān)鍵，只有充分研磨，細(xì)胞才能破碎，核酸才得以釋放[18]。

本試驗(yàn)是在CTAB法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的，以傳統(tǒng)的CTAB法為對(duì)照，但是由于成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)和其他次生代謝物質(zhì)，傳統(tǒng)的CTAB法無(wú)法提取天門冬的DNA，電泳結(jié)果為空白，故本試驗(yàn)只對(duì)改良CTAB法進(jìn)行分析和PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

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