耳針、中藥對衰老大鼠海馬神經(jīng)元NGF、BDNF蛋白表達的影響

劉億淑 呂明莊

摘要：目的：通過觀測耳針、六味地黃丸加味丹參對D-半乳糖衰老大鼠海馬組織神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的蛋白表達的影響，探討耳針、六味地黃丸加味丹參預防和延緩衰老的可能機理，為耳針、中藥延緩衰老在臨床上的運用提供新的理論和實驗依據(jù)。結(jié)果：：1、耳針組、中藥組、耳針+中藥組海馬組織NGF蛋白表達增加，與模型組相比較，差異具有顯著性（P<0.01或P<0.05）。其中耳針+中藥組與耳針組、中藥組比較，差異有顯著性（P<0.01）；耳針組與中藥組比較，差異無顯著性（P>0.05）。2、耳針組、中藥組、耳針+中藥組海馬組織BDNF蛋白表達增加，與模型組相比較，差異具有顯著性（P<0.01或P<0.05）。其中耳針+中藥組與耳針組、中藥組比較，差異有顯著性（P<0.01）；耳針組與中藥組比較，差異無顯著性（P>0.05）。結(jié)論：耳針、中藥具有延緩衰老的作用，從神經(jīng)內(nèi)分泌角度看，其可能的作用機理是：耳針、中藥促進內(nèi)源性神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達，發(fā)揮其營養(yǎng)、支持、保護神經(jīng)細胞、抑制細胞凋亡的作用，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能最終達到延緩衰老的目的。

關鍵詞：衰老； 耳針；中藥； 海馬； 神經(jīng)生長因子； 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

【中圖分類號】R453【文獻標識碼】 A【文章編號】1002-3763（2014）09-0071-02目前全球都面臨人口老齡化問題，老年人口的增多帶來了一系列社會和經(jīng)濟問題。因此，對衰老機制和延緩衰老的研究日益受到重視，其中神經(jīng)系統(tǒng)的老齡性退行性變化引起的疾病，如老年癡呆、帕金森病等已成為醫(yī)學領域中研究的熱點，受到普遍關注。本研究采用D-半乳糖致衰老的方法復制衰老大鼠模型，以海馬神經(jīng)元神經(jīng)營養(yǎng)素家族成員神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達以及雌鼠血清非肽類神經(jīng)生長因子雌激素（E2）的含量作為檢測指標，探討耳針、中藥預防和延緩衰老的可能途徑，探索其延緩衰老作用的新機制，為耳針、中藥延緩衰老在臨床上的運用提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：

1.1.1 動物：Wistar健康大鼠70只，清潔級，雌雄各半，雙耳無缺損，3～4月齡，體重250～300g（由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供），造模前在相同光照條件大鼠適應性喂養(yǎng)1周，雌雄分開，自由攝取標準飼料（由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供），飲用干凈自來水，室溫控制在15～18℃之間，濕度70%左右。

1.1.2 主要試劑和儀器：六味地黃丸：貴陽德昌祥藥業(yè)有限公司；丹參：貴陽阜康堂藥業(yè)公司；SOD試劑盒：南京建成生物工程有限公司；MDA試劑盒：南京建成生物工程有限公司

BDNF免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；NGF免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；撳針（耳針）：北京環(huán)亞醫(yī)藥器械公司；臺式高速離心機：上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組：70只 Wistar健康大鼠隨機分為5組，每組14只（雌雄各半，分開飼養(yǎng)），即對照組、模型組、耳針組、中藥組、耳針+中藥組。

1.2.2 動物模型建立[1]：Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用國際上公認的D-半乳糖復制衰老模型。6周后，取大鼠靜脈血測血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。模型組與對照組比較，模型組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增高（見表1、2），證明模型復制成功。

1.3 治療方法

1.3.1 耳針組：在造模同時進行耳針治療，根據(jù)華興邦《實驗動物與動物實驗》中及林文注[2] 、李辭蓉[3]所介紹的動物穴位定位，選取大鼠雙側(cè)耳穴（腎穴、脾穴、肝穴）以撳針按壓后固定留置于耳上。

1.3.2 中藥組：在造模同時每日給予六味地黃丸（由熟地、山藥、山萸肉、茯苓、澤瀉、牡丹皮組成）加丹參磨制成中藥粉末，每只大鼠每日按成人劑量的10倍給藥，拌入飼料后混勻，自由攝食。

1.3.3 耳針+中藥組：造模同時進行耳針+中藥治療，取穴及中藥喂服方法同前。以上治療時間均為6周[1]。

1.4 指標及檢測

1.4.1 血清SOD、MDA的檢測

血清SOD、MDA的檢測均按試劑盒說明書操作。SOD的活性采用黃嘌呤氧化酶法檢測； MDA的含量采用硫代巴比妥酸（TAB）法檢測。

1.4.2 NGF、BDNF的免疫組織化學染色，

1.4.3 免疫組化染色陽性結(jié)果判斷：陽性信號主要位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色或黃色者為陽性細胞。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理及圖像分析：數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行儲存、整理、分析，各項指標采用均數(shù)±標準差表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析及q檢驗。

圖像資料采用貴陽醫(yī)學院病理科Biomias99圖像分析系統(tǒng)。取視場面積443268um2，每張切片在顯微鏡的10×40倍目鏡下隨機選5個視場，通過攝像頭采集圖像進入Biomias99圖像分析系統(tǒng)，每個視場內(nèi)選取5個陽性表達區(qū)域進行光密度（OD）測定，取其平均值即為該切片的平均光密度。所有OD值測量均在相同光學、光源條件下完成。用鼠標點擊法計數(shù)陽性（表達）細胞。記錄各組海馬區(qū)NGF和BDNF的陽性細胞數(shù)及其表達的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察結(jié)果：對照組大鼠毛發(fā)光澤、順滑，皮膚彈性好，行動敏捷，自主活動佳，大便成形，呈黃褐色，無腥臭。模型組大鼠毛發(fā)枯黃、無光澤，皮膚粗糙、彈性差，行動遲緩，自主活動明顯降低，大便較稀，較為腥臭。其余治療組大鼠上述表現(xiàn)較模型組均見良性逆轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化（見表1）

表1 各組大鼠血清SOD活性的比較（X±S）

Tab-1 The Comparison of Serum SOD Activity among Groups（X±S）

組 別 例 數(shù) SOD（NU/ml）對 照 組13659.15±126.33模 型 組12 314.65±118.49 #耳 針 組14553.12±61.80*中 藥 組14553.02±83.38*耳針+中藥組14 606.31±73.12*△▲注：與對照組比較 # ：P<0.01 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.05 與中藥組比較 ▲：P<0.05

表2 各組大鼠血清MDA含量的比較（X±S）

Tab-2 The Comparison of Serum MDA Content among Groups（X±S）

組 別 例 數(shù) MDA（nmol/ml）對 照 組130.65±0.40模 型 組122.03±0.68#耳 針 組141.15±0.44*中 藥 組141.40±0.31*耳針+中藥組14 0.64±0.31*△▲注：與對照組比較 # ：P<0.001 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.01 與中藥組比較 ▲：P<0.01

由表2統(tǒng)計結(jié)果表明：與對照組比較，模型組血清MDA含量顯著升高（P<0.001）；耳針組、中藥組、耳針+中藥組與模型組比較，血清MDA含量均有明顯降低（P<0.05）；三個治療組間兩兩比較，耳針+中藥組MDA含量低于耳針組、中藥組（P<0.01）；耳針組、中藥組間差異無顯著性（P>0.05）。

2.3 各組大鼠血清丙二醛（MDA）含量的變化（見表2）

2.4 海馬組織神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF）免疫組織化學染色結(jié)果（見表3）

由表1統(tǒng)計分析表明：與對照組比較，模型組血清SOD活性顯著降低（P<0.01）；耳針組、中藥組、耳針+中藥組與模型組比較，血清SOD活性均有明顯升高（P<0.05）；三個治療組間兩兩比較，耳針+中藥組SOD活性高于耳針組、中藥組（P<0.05）；耳針組、中藥組間差異無顯著性（P>0.05）。

表3 各組NGF免疫陽性細胞數(shù)目和平均光密度比較（X±S）

Tab-3 The comparison of amount of Immunal positive cell and meaning of lingt density of NGF among groups （X±S）

組 別例 數(shù) 陽性細胞數(shù) 平均光密度對 照 組818.51±1.7288.99±3.17模 型 組82.42±1.16#185.74±9.81#耳 針 組810.89±1.18*140.60±3.44*中 藥 組810.66±1.16*140.21±3.44*耳針+中藥組816.22±1.48*△▲93.24±3.41*△▲注：與對照組比較 # ：P<0.01 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.01 與中藥組比較 ▲：P<0.01

2.5 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BNGF）免疫組織化學染色結(jié)果（見表4）

表4 各組BDNF免疫陽性細胞數(shù)目和平均光密度比較（X±S）

Tab-4 The comparison of amount of Immunal positive cell and meaning of lingt density of BDNF among groups （X±S）

組 別例 數(shù) 陽性細胞數(shù) 平均光密度對 照 組819.6±1.5294.44±4.38模 型 組8 2.47±1.27#192.69±3.94#耳 針 組8 8.93±1.31*152.30±3.13*中 藥 組89.45±1.06*151.92±2.88*耳針+中藥組815.23±1.42*△▲116.04±2.35*△▲注：與對照組比較 # ：P<0.01 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.01 與中藥組比較 ▲：P<0.01

3 討論

衰老的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)學說認為，機體在神經(jīng)系統(tǒng)的控制下，通過神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，完成其生長、發(fā)育、成熟、衰老乃至死亡這一系列生物過程。神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)各個環(huán)節(jié)的增齡性衰退變化，都將加速衰老過程。有實驗研究顯示[4-8]，老年癡呆、帕金森病、亨廷頓氏舞蹈癥等老年性退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展可能與缺乏神經(jīng)營養(yǎng)家族（NTs）成員如NGF、BDNF的營養(yǎng)作用有關。

現(xiàn)代研究認為[9]，耳針對機體的作用是神經(jīng)體液綜合調(diào)節(jié)的結(jié)果。針刺或貼壓耳穴可調(diào)節(jié)臟腑和器官功能活動，提高機體免疫功能，改善腎虛，改善激素水平，從而達到延緩衰老的目的[10]。本研究根據(jù)辨證選穴原則，選取耳穴“腎”、“脾”、“肝”?！澳I”穴具有培補腎氣、填精補髓、培元固本的作用，“脾”穴能養(yǎng)胃健脾、益氣輸津，“肝”穴具有調(diào)暢氣機、活血化瘀的作用，三穴共奏扶正祛瘀之功，以達延緩衰老之效。

大量的動物實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫功能、改善微循環(huán)、提高應激能力、延長機體生存壽命、延緩衰老等功能[11-14]。此外，現(xiàn)代醫(yī)學還利用基因芯片技術發(fā)現(xiàn)[15]，六味地黃丸可調(diào)節(jié)相關基因的表達水平，從而調(diào)節(jié)機體功能，起到延緩衰老的作用。丹參有很強的抗氧化作用，能消除自由基，增強機體的抗氧化能力，能保護DNA，上調(diào)bcl-2表達 ，對神經(jīng)細胞凋亡有明顯的抑制作用[16]。此外，丹參提取物可有效改善氧化衰老模型小鼠的免疫狀態(tài)[17]。

本研究提示耳針、中藥延緩衰老的機制可能是：耳針、中藥能促進海馬組織內(nèi)源性NGF、BDNF表達，發(fā)揮其對神經(jīng)元細胞的營養(yǎng)、支持和保護作用，延緩神經(jīng)系統(tǒng)的老齡性改變，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，從而起到扶正化瘀、調(diào)節(jié)陰陽、疏經(jīng)通絡、調(diào)整臟腑功能的作用，最終達到延緩衰老目的。同時，本實驗還發(fā)現(xiàn)，耳針+中藥組各項指標均優(yōu)于耳針組和中藥組，且差異具有顯著性，說明耳針與中藥具有協(xié)同作用，這可能與耳針、中藥共同發(fā)揮了增強免疫、調(diào)節(jié)自由基、調(diào)節(jié)脂代謝、改善激素水平等功能有關。

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