魏 巍，余夢(mèng)瑤，許曉燕，韓嘉鈺，3，江 南，鄭林用， 李文濤，3，羅 霞**

(1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041; 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066; 3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064)

出芝溫度對(duì)靈芝基質(zhì)物質(zhì)含量和酶活的影響*

魏 巍1，余夢(mèng)瑤1，許曉燕1，韓嘉鈺1，3，江 南1，鄭林用2， 李文濤1，3，羅 霞1**

(1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041; 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066; 3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064)

研究了25℃、30℃和35℃三個(gè)出芝溫度條件下，利用人工氣候箱袋式栽培靈芝，其基質(zhì)不同時(shí)期-部位的物質(zhì)含量(總糖、還原糖、水溶性蛋白和游離氨基酸)與木質(zhì)素酶系酶(漆酶和錳過氧化物酶)、纖維素酶系酶(羧甲基纖維素酶和濾紙酶)和酸性蛋白酶活性變化規(guī)律。結(jié)果顯示，在25℃時(shí)，靈芝能夠正常出芝，溫度高于30℃以后子實(shí)體分化受到抑制；且在25℃條件下，不同時(shí)期-部位基質(zhì)中總糖和可溶性蛋白含量低于其它2個(gè)溫度處理組，而還原糖和游離氨基酸含量高于其它2個(gè)溫度處理組；同時(shí)，不同時(shí)期-部位基質(zhì)中木質(zhì)素酶系和纖維素酶系酶活力低于其它2個(gè)溫度處理組，但酸性蛋白酶活力高于另外其它2個(gè)溫度處理組。提示袋料靈芝栽培時(shí)出芝溫度控制在25℃左右利于其子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育。

靈芝；袋料；溫度；出芝；酶活

靈芝(Ganodermalucidum)作為1種在民間及臨床應(yīng)用廣泛且具有極高藥用價(jià)值的名貴藥用真菌，被《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)與《美國(guó)草藥藥典與治療概要》收錄，其現(xiàn)代研究、開發(fā)與應(yīng)用已受到國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者的重視[1]。

溫度作為靈芝生長(zhǎng)發(fā)育過程中相當(dāng)重要的環(huán)境因素，目前研究?jī)H限于其對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度、子實(shí)體產(chǎn)量等農(nóng)藝指標(biāo)的影響[2-4]，尚未見出芝溫度對(duì)靈芝營(yíng)養(yǎng)代謝影響的深入研究報(bào)道。

在現(xiàn)有食(藥)用菌營(yíng)養(yǎng)代謝變化規(guī)律的研究中，往往將基質(zhì)內(nèi)菌絲體或子實(shí)體視為1個(gè)整體，僅按照不同時(shí)間進(jìn)行取樣分析[5]，而忽視了菌絲體和子實(shí)體不同部位因生長(zhǎng)時(shí)間的不同、發(fā)育階段的不同而導(dǎo)致的分化，使得研究結(jié)果存在一定的局限性。

本論文采用時(shí)空模式的研究思路，研究了出芝溫度對(duì)靈芝不同時(shí)期-部位基質(zhì)的物質(zhì)含量和酶活力的影響，為深入探究靈芝袋料栽培過程中最適出芝溫度條件及其機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

靈芝ZL13，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

木屑、棉籽殼、玉米芯、麥麩、石灰和石膏購(gòu)自農(nóng)資市場(chǎng)，ABTS和木聚糖購(gòu)自Sigma公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 供試培養(yǎng)基

1.3.1 母種培養(yǎng)基配制

土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。

1.3.2 原種培養(yǎng)基配制

玉米粒99%、石膏1%，pH自然，含水量60%左右。

1.3.3 栽培培養(yǎng)基配制

木屑15%、棉籽殼60%、玉米芯15%、麥麩8%、石灰1%、石膏1%，pH5～6，含水量60%左右。將木屑、麥麩、玉米芯、石灰和石膏混合均勻，摻入預(yù)濕24 h的玉米芯中拌勻。選用23 cm×42 cm×0.03 cm的聚乙烯袋，每袋裝濕料 2 000 g，121℃高壓滅菌2.5 h，冷卻至室溫后每袋接入玉米粒原種10粒。

1.4 培養(yǎng)條件及栽培方法

菌絲生長(zhǎng)階段的培養(yǎng)條件為25℃，避光，濕度50%～60%；出芝階段培養(yǎng)條件為光照300 lx，濕度90%，溫度處理分25℃、30℃和35℃進(jìn)行。所有催蕾及出芝均在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行。

1.5 采樣方法及粗酶液制備

把靈芝生殖生長(zhǎng)期分為5個(gè)階段：菌絲滿袋(時(shí)期1)、原基期(時(shí)期2：靈芝剛長(zhǎng)出白色球狀子實(shí)體)、菌蕾期(時(shí)期3：白色球狀子實(shí)體開始分化，有突起產(chǎn)生)、開片期(時(shí)期4：靈芝為腎形，有淡黃色邊緣)、子實(shí)體成熟期(時(shí)期5：彈射孢子)。將培養(yǎng)料均分為4部分，分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，具體采樣方法如表1所示。

表1 取樣表

準(zhǔn)確稱取同時(shí)期同一待測(cè)樣品2份，每份5 g，將其中1份稱好的樣品放入50 mL三角瓶中，加蒸餾水25 mL，在40 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸提2 h，3層紗布過濾，10 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液，用于測(cè)定酶活；另外1份在80℃恒溫干燥箱內(nèi)烘至恒重，用于確定基質(zhì)干重。設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6 基質(zhì)中物質(zhì)含量的測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定總糖[6]和還原糖的含量；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量；采用茚三酮顯色法測(cè)定游離氨基酸含量。

1.7 基質(zhì)中胞外酶活性的測(cè)定

漆酶活力采用ABTS法測(cè)定[7]；錳過氧化物酶活力采用Mn(Ⅱ)氧化法測(cè)定[7]；纖維素酶和濾紙酶活力采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定[8]；酸性蛋白酶活性采用福林-酚試劑法測(cè)定[9]。

漆酶活力單位定義為每分鐘催化1 μmolABTS氧化所需要的酶量；錳過氧化物酶活力單位定義為每分鐘使吸光度值增加0.1的酶量；纖維素酶和濾紙酶活力單位定義為每分鐘催化生成1 mg葡萄糖所需要的酶量；酸性蛋白酶活力單位定義為每克干料1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同出芝溫度對(duì)靈芝子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育的影響

在本研究中，靈芝生殖生長(zhǎng)期均在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行，以便能夠精準(zhǔn)地控制靈芝出芝溫度。靈芝菌絲滿袋后，將菌袋移入3個(gè)溫度分別設(shè)定為25℃、30℃和35℃的人工氣候箱內(nèi)(無晝夜溫差)。研究結(jié)果表明，在25℃培養(yǎng)條件下，靈芝能夠正常出芝；當(dāng)溫度為30℃時(shí)，靈芝能出原基，但是由于培養(yǎng)溫度稍高，靈芝原基很快干縮，不能正常分化開片；在35℃時(shí)，靈芝則不能出原基。

2.2 不同時(shí)期-部位基質(zhì)中總糖和還原糖含量的變化規(guī)律

不同出芝溫度下，靈芝生殖生長(zhǎng)期內(nèi)不同時(shí)期和部位基質(zhì)中總糖和還原糖含量變化規(guī)律如圖1所示。在不同培養(yǎng)溫度下，不同部位基質(zhì)中總糖含量差異不大。當(dāng)出芝溫度為25℃和30℃時(shí)，部位-Ⅰ、部位-Ⅱ和部位-Ⅳ基質(zhì)中總糖含量變化規(guī)律相同，即先升高后下降，然而部位-Ⅲ中總糖含量變化趨勢(shì)卻與其他部位相反。在35℃培養(yǎng)條件下，不同部位基質(zhì)中總糖含量一直呈升高趨勢(shì)。

圖1結(jié)果顯示，溫度對(duì)基質(zhì)中還原糖含量的影響較大，在25℃培養(yǎng)條件下，各部位基質(zhì)中還原糖含量始終高于30℃和35℃處理組。在靈芝的生殖生長(zhǎng)期內(nèi)，30℃和35℃對(duì)基質(zhì)中還原糖含量的影響基本相同，即還原糖含量都維持在較低水平，無較大波動(dòng)。

2.3 不同時(shí)期-部位基質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的變化規(guī)律

基質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量在不同出芝溫度下各時(shí)期及各部位的變化規(guī)律如圖2所示。

從圖2可以看出，可溶性蛋白質(zhì)含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且當(dāng)培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，不同部位基質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)含量始終低于另外2個(gè)處理組。溫度對(duì)基質(zhì)各部位中游離氨基酸含量變化趨勢(shì)影響不明顯，在不同溫度處理下，游離氨基酸含量從滿袋期至原基時(shí)期呈升高趨勢(shì)，其含量均在原基期出現(xiàn)1個(gè)峰值然后略有下降。由圖2可知，25℃時(shí)，不同時(shí)期和部位基質(zhì)中游離氨基酸含量總體高于其他2個(gè)溫度處理。

2.4 不同時(shí)期-部位基質(zhì)中木質(zhì)素酶系酶活的變化規(guī)律

2.4.1 不同溫度對(duì)漆酶活性變化規(guī)律的影響

靈芝生殖生長(zhǎng)階段溫度對(duì)不同時(shí)期和部位基質(zhì)中漆酶活性變化規(guī)律如圖3所示。

總體來看，生殖生長(zhǎng)階段漆酶活性先經(jīng)歷1個(gè)上升階段最終呈下降趨勢(shì)，溫度對(duì)漆酶活性峰值出現(xiàn)的時(shí)期有一定影響。25℃時(shí)，基質(zhì)部位-Ⅰ的漆酶酶活原基期出現(xiàn)1個(gè)高峰，隨后急劇下降，并穩(wěn)定在較低水平；30℃時(shí)，漆酶活性總體處于較高水平，部位-Ⅰ處漆酶酶活在開片期(時(shí)期4)達(dá)到最高；35℃時(shí)，漆酶活性的峰值則出現(xiàn)在菌蕾期。

2.4.2 不同溫度對(duì)錳過氧化物酶活性變化規(guī)律的影響

不同溫度對(duì)錳過氧化物酶活性變化規(guī)律的影響情況見圖4。

從圖4可以看出，錳過氧化物酶活性變化趨勢(shì)與漆酶活性變化趨勢(shì)類似，溫度對(duì)其影響也基本相同，但部位-Ⅰ、部位-Ⅱ在30℃時(shí)的峰值提前到原基時(shí)期(時(shí)期1)，而當(dāng)溫度為25℃和35℃時(shí)，錳過氧化物酶活力在菌蕾期(時(shí)期3)和開片期(時(shí)期4)出現(xiàn)峰值。當(dāng)培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，各部位基質(zhì)中錳過氧化物酶活力略低于另外2個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

2.5 不同時(shí)期-部位基質(zhì)中纖維素酶系酶活變化規(guī)律

2.5.1 不同溫度對(duì)羧甲基纖維素酶活性變化規(guī)律的影響

不同溫度對(duì)羧甲基纖維素酶活性變化規(guī)律的影響見圖5。

從圖5可以看出，隨著靈芝的生長(zhǎng)發(fā)育，靈芝生殖生長(zhǎng)階段基質(zhì)內(nèi)羧甲基纖維素酶活性總體呈上升趨勢(shì)。溫度對(duì)不同時(shí)期和部位基質(zhì)中羧甲基纖維素酶活力的影響較大，25℃時(shí)基質(zhì)-Ⅰ內(nèi)的羧甲基纖維素酶活性較低，變化趨勢(shì)平穩(wěn)且始終低于30℃和35℃處理組。

2.5.2 不同溫度對(duì)濾紙酶活性變化規(guī)律的影響

溫度對(duì)靈芝生殖生長(zhǎng)階段不同時(shí)期和部位基質(zhì)中濾紙酶活性變化的影響與對(duì)羧甲基纖維素酶活性影響相似，結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出，25℃時(shí)濾紙酶活性在原基期(時(shí)期2)最低，然后有所升高，但總體活性水平仍低于其余2個(gè)溫度實(shí)驗(yàn)組。在30℃和35℃條件下，不同時(shí)期和部位基質(zhì)中靈芝濾紙酶活力波動(dòng)較大，且活力較高。

2.6 不同時(shí)期-部位基質(zhì)中酸性蛋白酶活性的變化規(guī)律

靈芝生殖生長(zhǎng)階段內(nèi)，溫度對(duì)不同時(shí)期和部位基質(zhì)中酸性蛋白酶活性變化規(guī)律的影響如圖7所示。

從圖7可以看出，25℃時(shí)，酸性蛋白酶活力總體呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢(shì)，其中部位-Ⅰ、部位-Ⅱ、部位-Ⅲ在菌蕾期(時(shí)期3)活性有峰值，而部位-Ⅳ酶活的峰值出現(xiàn)在原基期，各部位在成熟期(時(shí)期5)酸性蛋白酶活性有所升高。30℃、35℃時(shí)，酸性蛋白酶活性在原基期(時(shí)期2)降至最低后基本維持不變。結(jié)果顯示，出芝溫度為25℃時(shí)，靈芝酸性蛋白酶活力較高，而其它2個(gè)實(shí)驗(yàn)組中酸性蛋白酶活力則較低，并且始終低于25℃處理組。

3 討論

食(藥)用菌在菌絲生長(zhǎng)階段，通過分解基質(zhì)內(nèi)的木質(zhì)素和纖維素等，合成、儲(chǔ)存子實(shí)體發(fā)育所需的能量物質(zhì)[10]，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)期后通過分解儲(chǔ)存的能量物質(zhì)供應(yīng)子實(shí)體的發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，出芝溫度在25℃時(shí)，靈芝可正常出芝；30℃時(shí)，僅分化原基；35℃時(shí)完全不出芝。推測(cè)在25℃時(shí)由于靈芝能正常出芝，故需要將基質(zhì)中儲(chǔ)存的能量物質(zhì)分解以供應(yīng)其子實(shí)體生長(zhǎng)，因而其基質(zhì)的不同時(shí)期-部位的還原糖含量均高于30℃和35℃處理組，而總糖含量則低于30℃和35℃處理組。

在本研究中，不同溫度條件下，靈芝生殖生長(zhǎng)階段不同時(shí)期-部位的基質(zhì)中木質(zhì)素酶系的漆酶和錳過氧化物酶整體均呈現(xiàn)小幅下降的趨勢(shì)，這可能是由于大量木質(zhì)素在菌絲生長(zhǎng)階段已經(jīng)被降解，生殖生長(zhǎng)階段靈芝菌絲很少再分泌該類酶，因此溫度對(duì)其影響不大。由于植物組織中木質(zhì)素與纖維素以共價(jià)鍵形式緊密結(jié)合，并將纖維素分子包埋在其中，木質(zhì)素降解后再開始降解纖維素，因此纖維素酶系的羧甲基纖維素酶和濾紙酶在生殖生長(zhǎng)階段活性會(huì)開始增加[8，11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)靈芝生殖生長(zhǎng)階段不同時(shí)期-部位基質(zhì)中纖維素酶系的酶活力影響顯著，而且隨著溫度升高其酶活力增加，較高的溫度更利于纖維素酶的分泌。

真菌菌絲體中富含蛋白酶，蛋白酶在菌絲體生長(zhǎng)過程中參與蛋白質(zhì)的水解，為菌絲體提供氮源類物質(zhì)[12]。靈芝轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)期之后，基質(zhì)中的蛋白酶活力逐漸升高，用于滿足靈芝子實(shí)體發(fā)育對(duì)氮源的需求，因此在靈芝生殖生長(zhǎng)階段，其基質(zhì)中可溶性蛋白含量下降，而游離氨基酸含量逐漸上升。到了子實(shí)體發(fā)育后期，由于靈芝對(duì)CN需求的變化，靈芝胞外蛋白酶活力迅速下降并維持在較低水平。溫度對(duì)蛋白酶活力影響較大，當(dāng)出芝溫度25℃時(shí)，靈芝基質(zhì)的不同部位-時(shí)期的蛋白酶活力均高于30℃和35℃處理組，提示蛋白酶活力與子實(shí)體正常發(fā)育密切相關(guān)。

綜上所述，溫度對(duì)靈芝子實(shí)體形成具有顯著的影響，在高于30℃的恒定溫度條件下靈芝很難分化子實(shí)體，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。在實(shí)際生產(chǎn)中，靈芝大棚溫度需注意保持在25℃左右，避免長(zhǎng)期高于30℃，否則會(huì)嚴(yán)重影響靈芝的正常生長(zhǎng)。

[1]林志彬. 靈芝的現(xiàn)代研究(第三版)[M]. 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007：1-359.

[2]Adaskaveg JE, Gilbertson RL. Cultural studies of four North American species in theGanodermalucidumcomplex with comparisons toG.lucidumandG.tsugae[J]. Mycological Research, 1989, 92(2): 182-191.

[3]韋會(huì)平，劉正宇，譚楊梅，等. 溫度條件對(duì)金佛山靈芝生長(zhǎng)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21(10)：85-87.

[4]劉雁英，李林輝，謝富剛，等. 食用菌子實(shí)體分化發(fā)育研究進(jìn)展[J]. 菌物研究，2010，8(1)：57-62.

[5]韋會(huì)平，李學(xué)剛，蒲盛才. 靈芝生長(zhǎng)過程中靈芝多糖含量變化規(guī)律研究[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，34(5)：10-12.

[6]孫偉偉，曹維強(qiáng)，王靜. DNS法測(cè)定玉米秸稈中總糖[J]. 食品研究與開發(fā)，2006，27(6)：120-124.

[7]劉建鵬，蘭進(jìn). 栽培靈芝胞外酶活性及多糖變化規(guī)律的初步研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2009，34(4)：483-485.

[8]倪新江，潘迎捷，馮志勇，等. 香菇生長(zhǎng)過程中幾種胞外酶活性的變化規(guī)律[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，1995，2(4)：22-27.

[9]王福榮，龐玉珍. 福林—酚試劑法測(cè)定蛋白酶活力的條件試驗(yàn)[J]. 調(diào)味副食品科技，1981(12)：23-26.

[10]Obodai M, Cleland-Okine J, Vowotor KA. Comparative study on the growth and yield ofPleurotusostreatusmushroom on different lignocellulosic by-products[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2003, 30(3): 146-149.

[11]薛海燕. 降解玉米秸稈產(chǎn)纖維素酶和木質(zhì)素酶菌種的篩選[J]. 釀酒科技，2008(10)：44-47.

[12]李艷茹，于海茹，許廣波，等. 豬苓菌絲體胞外蛋白酶和漆酶的酶學(xué)性質(zhì)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(6)：423-424.

Effects of Temperatures on the Substance Content and Extracellular Enzyme Activity of Culture Substrate DuringGanodermalucidumReproductive Stage

WEI Wei1, YU Meng-yao1, XU Xiao-yan1, HAN Jia-yu1,3, JIANG Nan1, ZHENG Lin-yong2, LI Wen-tao1,3, LUO Xia1

(1.Sichuan Academy of Chinese Medicine Science, SichuanChengdu610041; 2.Sichuan Academy of Agricultural Sciences, SichuanChengdu610066; 3.College of Life Sciences, Sichuan University, SichuanChengdu610064)

Under 25℃, 30℃ and 35℃ conditions, the changes of substance content (total sugar, reducing sugar, water soluble protein and free amino acid), lignin enzymes (laccase and manganese peroxidase), cellulose enzymes (carboxymethyl cellulase and filter paper enzyme), acid protease activity of bag culture substrate were studied duringGanodermalucidumreproductive stage in different periods of different parts. The results showed thatG.lucidumfruiting body could form at 25℃, and the formation was inhibited above 30℃. DuringG.lucidumreproductive stage, in different periods of different parts, the substrate total sugar and water soluble protein was lower at 25℃ than it at 30℃ and 35℃, and the reducing sugar and free amino acid contents was higher at 25℃ than it at the other two temperatures. The lignin enzymes and cellulase enzymes activity in the culture substrate at 25℃ was lower than it at the other two temperatures, and acid protease activity at 25℃ was higher than it at the other two temperatures. It provided that it was helpful for bag culturedG.lucidumfruiting body formation at about 25℃.

Ganodermalucidum; Bag culture; Temperature; Reproductive stage; Enzymes activities

*項(xiàng)目來源：國(guó)家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系藥用菌栽培崗位建設(shè)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：農(nóng)科教發(fā)[2007]12號(hào)；菌類藥材研究與開發(fā)四川省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，項(xiàng)目編號(hào)：2011JTD0021；四川省十二五育種攻關(guān)項(xiàng)目“菌類藥材優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的收集及新材料的選育”，項(xiàng)目編號(hào)：2011NZ0098-12-04；四川省公益性科研院所基本科研項(xiàng)目“袋料靈芝營(yíng)養(yǎng)代謝-藥效成分時(shí)空關(guān)聯(lián)模式的研究”，項(xiàng)目編號(hào)：A-2014N-6。

魏巍(1982-)，男，助理研究員，主要從事食(藥)用菌的研究與開發(fā)。

**通信作者：羅霞，E-mail：lx1443_cn@sina.com

2014-09-30

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0049-07